申请/专利权人：徐州医科大学

申请日：2019-01-21

公开（公告）日：2022-02-22

公开（公告）号：CN109705225B

主分类号：C07K19/00(20060101)

分类号：C07K19/00(20060101);C12N15/85(20060101);C12N15/867(20060101);A61K35/17(20150101);A61P35/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.02.22#授权;2019.05.28#实质审查的生效;2019.05.03#公开

摘要：本发明提供一种抗人CAIX抗原的嵌合抗原受体及其应用；所述嵌合型抗原受体由识别人CAIX抗原的scFv、铰链区、跨膜区和胞内信号结构域依次串联组成，通过杂交瘤抗体筛选系统筛选得到新的抗人CAIX的scFv，将该scFv与人CD8的Hinge和跨膜区、4‑1BB和CD3ζ的胞内信号结构域串联构建新的嵌合抗原受体scFv‑CD8‑4‑1BB‑CD3ζ，具有更高的特异性和更好的肿瘤杀伤效果。

主权项：1.一种抗人CAIX抗原的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由识别人CAIX抗原的单链抗体scFv、铰链区、跨膜区和胞内信号结构域依次串联组成；其中，所述识别人CAIX抗原的单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

全文数据：一种抗人CAIX抗原的嵌合抗原受体及其应用技术领域本发明属于生物医药技术领域，涉及一种抗人CAIX抗原的嵌合抗原受体及其应用。背景技术杂交瘤技术，即淋巴细胞杂交瘤技术，又称单克隆抗体技术。它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。1975年，克勒Kohler和米尔斯坦Milstein证明小鼠骨髓瘤细胞与免疫的小鼠脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体—单克隆抗体，这种技术称为杂交瘤技术。这一技术的基础是细胞融合技术。骨髓瘤细胞在体外可以连续传代，而脾细胞是终末细胞，不能在体外繁殖。如将小鼠的骨髓瘤细胞与分泌某种抗体的淋巴细胞融合，则融合细胞既具有肿瘤细胞无限繁殖的特性，又具有淋巴细胞能分泌特异性抗体的能力。经过对融合细胞的筛选可以获得分泌针对免疫抗原的单克隆细胞株，通过基因工程手段可以测序获得该抗体的重链可变区Hv和轻链Lv可变区编码序列，通过linker连接可拼接为scFv序列。嵌合抗原受体chimericantigenreceptor，CAR修饰的T细胞疗法是目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。嵌合抗原受体是模拟T细胞受体Tcellreceptor，TCR功能的人工受体，由抗原识别区、胞外铰链区、跨膜区以及胞内信号转导区组成。CAR修饰的T淋巴细胞能够通过其抗原识别区识别肿瘤细胞表面抗原，然后通过胞外铰链区和跨膜区将识别信号传递给胞内信号区激活T淋巴细胞的杀伤活性，杀死肿瘤细胞。根据胞内信号转导区含有共刺激分子的不同，CAR被划分为三代。第一代CAR的胞内信号转导区仅含有CD3ζ的胞内信号结构域，没有共刺激分子信号。第二代CAR的胞内信号转导区除含有CD3ζ的胞内信号结构域外，还含有一个共刺激分子通常为CD28或4-1BB。第三代CAR的胞内信号转导区除含有CD3ζ的胞内信号结构域外，还含有两个共刺激分子通常为CD28和4-1BB。目前CAR-T技术治疗肿瘤已经开展了大量的临床试验，其中抗CD19的CAR-T细胞治疗恶性血液病的效果尤其显著，据此美国FDA已经批准了两个产品上市。CAR-T技术在血液肿瘤治疗上的成功给实体瘤的治疗也带来了希望。以GD2为靶点的CAR-T治疗神经母细胞瘤或者的临床试验已经取得了可观的疗效，部分患者被完全治愈。CAIX是一种在肾癌细胞高表达的跨膜糖蛋白，也是目前所知唯一的肾癌特异性抗原。目前国际上注册以CAIX为靶点治疗肾癌的临床试验21项，已完成10项，包括Lamers等完成的针对CAIX的CAR-T细胞治疗肾癌研究。早在1996年Weijtens等构建由鼠抗人CAIX的scFv与FcRγ串联而成的CARscFv-FcRγ。2013年Lamers等报道该CAR-T细胞治疗肾癌的III期临床试验，遗憾的是受试的12名肾癌患者均未观察到临床客观疗效。因此，提供一种新的能提高对肾癌细胞的杀伤作用的抗人CAIX抗原的嵌合抗原受体，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。发明内容针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种抗人CAIX抗原的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合型抗原受体由识别人CAIX抗原的scFv、铰链区、跨膜区和胞内信号结构域依次串联组成，具有更高的特异性和更好的肿瘤杀伤效果。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供一种抗人CAIX抗原的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体由识别人CAIX抗原的单链抗体scFv、铰链区、跨膜区和胞内信号结构域依次串联组成；其中，所述识别人CAIX抗原的单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。SEQIDNO.1如下：QVQLKESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSKIYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRMAYYGYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSRNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQYYSTPLTFGAGTKLELK.本发明中，鉴于Lamers等LamersCH,KlaverY,GratamaJW,SleijferS,DebetsR.TreatmentofmetastaticrenalcellcarcinomamRCCwithCAIXCAR-engineeredT-cells-acompletedstudyoverview.BiochemSocTrans.2016；44:951-9.采用scFv-FcRγ修饰的T细胞没有效果，发明人利用杂交瘤抗体筛选系统筛选得到新的抗人CAIX的scFv，将该scFv与人CD8的Hinge和跨膜区、4-1BB和CD3ζ的胞内信号结构域串联构建新的嵌合抗原受体scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ；与Lamers的不同在于，本发明构建的CAR使用筛选得到的全新scFv作为靶点识别结构域，使用共刺激分子4-1BB和CD3ζ胞内段串联作为信号结构域，属于二代CAR，与Lamers的scFv-FcRγ相比对肾癌细胞具有更强的杀伤作用，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。优选地，所述识别人CAIX抗原的单链抗体scFv的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本发明所述识别人CAIX抗原的scFv的氨基酸序列是通过将人CAIX抗原免疫小鼠，然后通过杂交瘤技术得到表达抗人CAIX的杂交瘤克隆细胞株，再通过ELISA和流式细胞术筛选得到分泌抗CAIX抗体的阳性克隆株，再通过测序获得编码抗人CAIX的scFv的核苷酸序列，如SEQIDNO.2所示。SEQIDNO.2如下：CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTAAAGGGTCATTGAAACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATACCTACGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTAAAAGTAAGATTTATGCAACATATTATGCCGATTCAGTGAAAGACAGGTTCACCATCTCCAGAGATGATTCACAAAGCATGCTCTATCTGCAAATGAACAACTTGAAGACTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGTGAGAATGGCTTACTACGGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATATTGTGATGACGCAGGCTCCATCCTCCCTGGCTATGTCAGTAGGACAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTAAATAGTAGAAATCAAAAGAACTATTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGTCTCCTAAACTTCTGGTATACTTTGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGATTACTTCTGTCAGCAATATTATAGCACTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA.优选地，所述嵌合抗原受体的铰链区和跨膜区为人CD8的铰链区和跨膜区。优选地，所述嵌合抗原受体的铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。SEQIDNO.3如下：TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD.优选地，所述嵌合抗原受体的跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。SEQIDNO.4如下：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNH.优选地，所述嵌合抗原受体的铰链区的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。SEQIDNO.5如下：ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT.优选地，所述嵌合抗原受体的跨膜区的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。SEQIDNO.6如下：ATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACC.优选地，所述嵌合抗原受体的胞内信号结构域包括人4-1BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。优选地，所述人4-1BB的胞内信号结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示；SEQIDNO.7如下：KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL.优选地，所述人4-1BB的胞内信号结构域的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。SEQIDNO.8如下：AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG.优选地，所述CD3ζ的胞内信号结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示；SEQIDNO.9如下：RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR.优选地，所述CD3ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。SEQIDNO.10如下：AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC.优选地，所述嵌合抗原受体为scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ。优选地，所述scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ的氨基酸序列序列如SEQIDNO.11所示；SEQIDNO.11如下：QVQLKESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKSKIYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRMAYYGYFDVWGAGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSRNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQYYSTPLTFGAGTKLELKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR.优选地，核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。SEQIDNO.12如下：CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCTGGTGGAGGATTGGTGCAGCCTAAAGGGTCATTGAAACTCTCATGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAATACCTACGCCATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTGGAATGGGTTGCTCGCATAAGAAGTAAAAGTAAGATTTATGCAACATATTATGCCGATTCAGTGAAAGACAGGTTCACCATCTCCAGAGATGATTCACAAAGCATGCTCTATCTGCAAATGAACAACTTGAAGACTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGTGAGAATGGCTTACTACGGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGATATTGTGATGACGCAGGCTCCATCCTCCCTGGCTATGTCAGTAGGACAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTTTTAAATAGTAGAAATCAAAAGAACTATTTGGCCTGGTACCAGCAGAAACCAGGACAGTCTCCTAAACTTCTGGTATACTTTGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTTACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGATTACTTCTGTCAGCAATATTATAGCACTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCCTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGCAGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC.本发明的嵌合抗原受体的制备方法为：利用杂交瘤技术筛选获得表达抗人CAIX抗体的单克隆杂交瘤细胞株，测序得到抗人CAIX的单链抗体single-chainantibodyfragment,scFv序列，利用分子生物学技术将编码抗人CAIX的scFv序列、CD8的铰链区和胞内区、4-1BB和CD3ζ的胞内信号结构域的DNA序列依次串联起来，得到编码抗人CAIX抗原的嵌合抗原受体的编码基因；然后将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒；利用该慢病毒感染人T淋巴细胞，使细胞表达该嵌合抗原受体，这种T淋巴细胞能够识别肾癌细胞表面抗原CAIX，用于肾癌治疗。第二方面，本发明提供一种重组质粒，所述质粒包括第一方面所述的如SEQIDNO.10所示的核苷酸序列。第三方面，本发明提供一种慢病毒，所述慢病毒由第二方面所述的质粒和辅助质粒共包装得到。第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的抗人CAIX抗原的嵌合抗原受体、第二方面所述的重组质粒或第三方面所述的慢病毒用于制备治疗癌症的药物和或试剂盒的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：1本发明提供的嵌合抗原受体与Lamers等所用的抗人CAIX的CARscFv-FcRγ相比，利用杂交瘤抗体筛选系统筛选得到新的抗人CAIX的scFv，将该scFv与人CD8的Hinge和跨膜区、4-1BB和CD3ζ的胞内信号结构域串联构建新的嵌合抗原受体scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ；本发明提供的嵌合抗原受体显示了更好的杀伤肾癌细胞效果，具有更高的特异性；2本发明提供的嵌合抗原受体能够稳定表达于人T淋巴细胞膜表面，可以用于制备治疗肾癌的细胞治疗药物和或试剂盒，用于肾癌的治疗。附图说明图1A为本发明的PCR扩增编码全长人CAIX蛋白DNA片段结果图；图1B为本发明的人CAIX蛋白胞外段的DNA片段结果图；图2A为本发明的携带全长人CAIX蛋白编码基因的真核表达质粒pEGFP-CAIXfull阳性克隆的PCR鉴定结果图；图2B为本发明的携带人CAIX蛋白胞外段编码基因的原核表达质粒PET-28a-CAIXEX-GST的阳性克隆的PCR鉴定结果图；图3为本发明的人CAIX胞外段-GST融合蛋白小量表达A和纯化蛋白B的检测结果图；图4A为本发明用PE标记的抗人CAIX的抗体通过流式检测过表达pEGFP-CAIXfull的293T细胞的结果图；图4B为本发明的用过表达pEGFP-CAIXfull的293T细胞通过流式鉴定克隆6F7A5,5C9B7和10F11C10的细胞培养上清结果图；图5A为本发明用proteinG纯化后的6F7A5、5C9B7两个克隆抗体的SDS-PAGE检测结果图；图5B为本发明的proteinG纯化后的10F11C10克隆抗体的SDS-PAGE检测结果图；图6为本发明的CAIX6F7A5-CAR在人T细胞中的表达检测结果图，其中，A为对照CAR和CAIX6F7A5-CAR的结构模式图，B为Westernblot检测对照CAR和CAIX6F7A5-CAR在人原代T细胞中表达的图，C为流式细胞术检测对照CAR和CAIX6F7A5-CAR在人原代T细胞中表达的图；图7为本发明的CAIX6F7A5-CAR-T细胞在CAIX阳性肾癌细胞的刺激下能够有效释放细胞因子的结果图，其中，A为CAIX在4种靶细胞中表达量的流式检测图，B为4种靶细胞刺激后对照CAR-T细胞和CAIX6F7A5-CAR-T细胞细胞因子释放量的ELISA检测结果；图8为本发明的RTCA实验检测CAIX6F7A5-CAR-T细胞能够有效杀伤CAIX阳性的肾癌细胞Ketr-3A和OSRC-2B的结果图；图9为本发明的CAIX6F7A5-CAR-T细胞治疗能够显著延长人肾癌肺转移小鼠的生存期的结果图；图10A为本发明筛选的抗CAIXscFv6F7A5构建的CARCAIX6F7A5-CAR和Lamers用的抗CAIXscFvG250构建的CARCAIXG250-CAR在人原代T细胞中表达的流式检测结果图；图10B为本发明用3种肾癌细胞刺激后CAIX6F7A5-CAR-T细胞和CAIXG250-CAR-T细胞细胞因子释放量的ELISA检测结果；图10C为本发明的RTCA实验检测CAIX6F7A5-CAR-T细胞比CAIXG250-CAR-T细胞具有更强的肾癌细胞杀伤效果图。具体实施方式为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。实施例1编码全长人CAIX和CAIX胞外段DNA的克隆根据制备抗人CAIX单克隆抗体的实验要求，选择人CAIX的两个区间分别连接2个载体做克隆：CAIX胞外段38-414AA表达质粒PET-28a-CAIXEX、全长1-459AA表达质粒pEGFP-CAIXfull；通过PCR扩增，跑琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的片段长度与预期的一致，全长CAIX见图1A，CAIX胞外段见图1B，然后用DNA纯化试剂盒回收备用。实施例2全长人CAIX表达质粒pEGFP-CAIXfull和人CAIX胞外段表达质粒PET-28a-CAIXEX的构建将胶回收的编码全长人CAIX的DNA片段和表达载体pEGFP分别进行双酶切、将编码人CAIX胞外段的DNA片段和表达载体PET-28a的双酶切产物分别跑胶，并进行胶回收纯化；经过连接反应，然后转化感受态大肠杆菌细胞，待克隆长出后挑克隆并进行PCR鉴定；如图2A所示，挑出的8个pEGFP-CAIXfull都是阳性克隆；如图2B所示，挑出的8个PET-28a-CAIXEX也都是阳性克隆。实施例3人CAIX胞外段重组蛋白的表达纯化将重组表达质粒PET-28a-CAIXEX转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞，进行重组蛋白的诱导表达，如图3所示，小量表达检测结果说明重组蛋白CAIXEX-GST表达正确；扩大培养表达并纯化后的蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳检测，如图3所示，重组蛋白CAIXEX-GST的纯度在90％以上，能够满足免疫小鼠的要求。实施例4抗人CAIX胞外段单克隆抗体的制备纯化后的重组蛋白CAIXEX-GST经抗原乳化后，免疫5只BALBc小鼠，每2周免疫1次，共免疫5次，然后进行效价检测，结果见表1。表1为本发明的人CAIX抗原免疫小鼠抗血清效价表结果；表1如表1所示，第1#、2#、4#小鼠的效价均为1:32000，第3#和5#小鼠效价为1:64000。取高效价小鼠的脾脏，制备脾细胞，并于小鼠骨髓瘤细胞SP20细胞融合，经筛选培养基筛选得到融合细胞克隆，再经过多轮基于人CAIX胞外段抗原的ELISA筛选，获得33株阳性克隆，它们的效价如表2所示。表2为本发明的杂交瘤融合后经人CAIX免疫抗原筛选和GST标签蛋白反向筛选得到的33个阳性克隆株结果；表2这33株阳性克隆经过基于CAIX阴性表达的细胞株293T的ELISA筛选表3，表3为本发明的CAIX蛋白抗原ELISA筛选得到的33个克隆株经过基于293T细胞ELISA筛选结果；表3再经过基于过表达全长人CAIX的293T细胞的ELISA的筛选，选择OD值0.4的15个克隆为阳性克隆株表4和表5。表4为本发明的经过表达人CAIX的293T细胞的ELISA筛选得到的15个阳性克隆OD0.4结果；表4表5为本发明的6F7A5、5C9B7和10F11C10三个抗体的亚型测定结果；表5再选择OD值最高的三个克隆6F7A5、10F11C10和5C9B7进行流式检测，图4A为阳性对照，图4B检测结果显示6F7A5、10F11C10和5C9B7三个克隆均为阳性克隆。将三个克隆的杂交瘤细胞分别注射到BALBc小鼠腹腔，收集腹水，通过ProteinG亲和纯化，得到6F7A5抗体纯度95％，5C9B7抗体纯度98％图5A，10F11C10抗体纯度95％图5B。经过抗体亚型鉴定，3株抗体都为IgG1图5。对这三株抗体进行测序，得到scFv的DNA编码序列。利用分子生物学技术将编码抗人CAIX6F7A5的scFv序列、CD8的铰链区和胞内区、4-1BB和CD3ζ的胞内信号结构域的DNA序列依次串联起来，得到编码抗人CAIX抗原的嵌合抗原受体的编码基因。然后将该基因片段插入慢病毒表达载体，包装成慢病毒；利用该慢病毒感染人T淋巴细胞，使细胞表达该嵌合抗原受体。结果见图6所示，利用抗C-myc的抗体通过Westernblot实验检测发现在CAIX-CAR-T细胞中有55KD的蛋白条带，在Ctrl-CAR-T细胞中有30KD左右的蛋白条带，证实CAIX-CAR和Ctrl-CAR能够在T细胞中的正确表达；流式检测发现Ctrl-T细胞中Ctrl-CAR阳性率为91.7％，CAIX-CAR-T细胞中CAR阳性率为71.3％。实施例5ELISA法检测CAIX6F7A5-CAR-T细胞的细胞因子释放能力利用流式细胞仪检测Ketr-3、OSRC-2、293T、293T-CAIX细胞中CAIX的表达量。将293T、293T-CAIX、Ketr-3、OSRC-2细胞与CAR-T细胞按1:1比例共培养，孵育24h；收集上清采用ELISA方法检测CAR-T细胞分泌IFN-γ、GranzymeB、TNF-α、IL-2、IL-6和IL-10的量，结果见图7；图7显示经CAIX阳性表达的293T-CAIX、Ketr-3和OSRC-2细胞刺激后，CAIX6F7A5-CAR-T细胞释放IFN-γ、TNF-α、GranzymeB、IL-6、IL-2的水平明显高于Ctrl-T组；经CAIX阴性的293T细胞刺激后，CAR-T细胞释放IFN-γ、Perforin、GranzymeB、IL-10、IL-6的水平很低且与Ctrl-T细胞组相比无显著差异。说明CAIX6F7A5-CAR-T细胞对CAIX阳性细胞特异释放细胞因子的能力。实施例6体外细胞杀伤实验检测CAIX6F7A5-CAR-T细胞的杀伤能力为证实CAIX6F7A5-CAR-T细胞对靶细胞的特异性杀伤作用，我们选用xCELLigenceRTCADP细胞功能分析仪实时无标记地检测细胞杀伤，获取细胞杀伤曲线。接种以1×104孔接种靶细胞，观察细胞增殖曲线，待细胞处于增殖平台期时按照不同效靶比10:1的量加入效应细胞，实时观察杀伤曲线，结果见图8所示。由图8可知，CAIX6F7A5-CAR-T细胞对肾癌细胞OSRC-2和Ketr-3的杀伤作用明显强于Ctrl-T细胞。实施例7CAIX6F7A5-CAR-T对人肾癌肺转移小鼠的治疗效果通过尾静脉注射1×106个OSRC-2细胞构建NOG小鼠肺转移瘤模型。注射肿瘤细胞后7天，随机分3组未处理组、对照CAR-T组、CAIX6F7A5-CAR-T组，每组6只，分别尾静脉注射对照CAR-T和CAIX6F7A5-CAR-T进行治疗，1×107只，只在第7天注射一次，从注射细胞开始每天腹腔注射2000U的rhIL-2，结果见图9所示；由图9可知，实验结果显示CAIX6F7A5-CAR-T细胞与对照CAR-T细胞相比能够显著延长小鼠的生存期。实施例8CAIX6F7A5-CAR-T与抗人CAIXscFvG250制备的CAR-T的功能比较将本发明制备的抗人CAIX的scFv6F7A5和Lamers用的抗人CAIXscFvG250序列分别与人CD8的Hinge和跨膜区、4-1BB和CD3ζ的胞内信号结构域串联构建嵌合抗原受体CAIX6F7A5-CAR和CAIXG250-CAR，并制备CAR-T细胞。用实施例2中所述的ELISA方法检测这两种CAR-T在CAIX阳性肾癌细胞OSRC-2和KETR-3的刺激下细胞因子释放量的差异。用实施例3中所述的细胞杀伤的检测方法检测这两种CAR-T细胞对OSRC-2和KETR-3的杀伤作用，结果见图10A-图10C由图10A-图10C可知，结果发现CAIX6F7A5-CAR的细胞因子释放能力和杀伤功能都显著优于CAIXG250-CAR。综上所述，本发明提供一种抗人CAIX抗原的嵌合抗原受体及其应用；所述嵌合型抗原受体由识别人CAIX抗原的scFv、铰链区、跨膜区和胞内信号结构域依次串联组成，通过杂交瘤抗体筛选系统筛选得到新的抗人CAIX的scFv，将该scFv与人CD8的Hinge和跨膜区、4-1BB和CD3ζ的胞内信号结构域串联构建新的嵌合抗原受体scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ，具有更高的特异性和更好的肿瘤杀伤效果。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

权利要求：1.一种抗人CAIX抗原的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由识别人CAIX抗原的单链抗体scFv、铰链区、跨膜区和胞内信号结构域依次串联组成；其中，所述识别人CAIX抗原的单链抗体scFv的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述识别人CAIX抗原的单链抗体scFv的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的铰链区和跨膜区为人CD8的铰链区和跨膜区；优选地，所述嵌合抗原受体的铰链区的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示；优选地，所述嵌合抗原受体的跨膜区的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示；优选地，所述嵌合抗原受体的铰链区的核苷酸序列SEQIDNO.5所示；优选地，所述嵌合抗原受体的跨膜区的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞内信号结构域包括人4-1BB的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述人4-1BB的胞内信号结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.7所示；优选地，所述人4-1BB的胞内信号结构域的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。6.根据权利要求4或5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD3ζ的胞内信号结构域的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示；优选地，所述CD3ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示。7.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ；优选地，所述scFv-CD8-4-1BB-CD3ζ的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示；优选地，核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。8.一种重组质粒，其特征在于，所述质粒包括权利要求7所述的如SEQIDNO.12所示的核苷酸序列。9.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒由权利要求8所述的质粒和辅助质粒共包装得到。10.一种如权利要求1-7中任一项所述的抗人CAIX抗原的嵌合抗原受体、权利要求8所述的重组质粒或权利要求9所述的慢病毒用于制备治疗癌症的药物和或试剂盒的应用。

百度查询： 徐州医科大学 一种抗人CAIX抗原的嵌合抗原受体及其应用

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