申请/专利权人：深圳华大智造科技股份有限公司

申请日：2017-09-20

公开（公告）日：2022-11-01

公开（公告）号：CN109536594B

主分类号：C12Q1/6869

分类号：C12Q1/6869

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.11.01#授权;2019.04.23#实质审查的生效;2019.03.29#公开

摘要：本申请公开了一种用于SmallRNA的测序方法、测序试剂和应用。本申请用于SmallRNA的测序方法，包括在对混合样本的环状文库进行测序时，向引物溶液中添加正常测序引物和阻断测序引物，采用混合引物进行测序；阻断测序引物由正常测序引物3’末端羟基经化学修饰而成。本申请的测序方法，通过添加阻断测序引物，使得混合样本环状文库SmallRNA测序得以实现，并能有效的保障标签序列的测序，进而提高了数据利用率，得到良好的拆分率。本申请的SmallRNA测序方法和测序试剂，为SmallRNA混合样本测序提供了一种新的思路和方案，解决了目前的环状文库SmallRNA测序的测序资源浪费等问题。

主权项：1.一种用于SmallRNA的测序方法，其特征在于：包括在对混合样本的环状文库进行测序时，采用混合引物进行测序，所述混合引物由正常测序引物和阻断测序引物组成；所述阻断测序引物由所述正常测序引物的3’末端的羟基经过化学修饰而成，所述化学修饰为对羟基中的H进行替换；所述阻断测序引物占所述混合引物总量的10%-70%；所述SmallRNA为18-30nt的片段。

全文数据：一种用于SmallRNA的测序方法、测序试剂和应用技术领域本申请涉及基因测序领域，特别是涉及一种用于SmallRNA的测序方法、测序试剂和应用。背景技术SmallRNA，包括microRNAs、siRNAs和piRNAs，是一大类调控分子，几乎存在于所有的生物体中，是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢和疾病的发生等生理过程中都起着重要的作用。通过对SmallRNA大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的SmallRNA图谱，实现包括新SmallRNA分子的挖掘，SmallRNA作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、SmallRNA聚类和表达谱分析等科学应用。SmallRNA通过多种多样的作用途径，包括mRNA降解、翻译抑制、异染色质形成以及DNA去除等，来调控生物体的生长发育和疾病发生，因此SmallRNA具有很高的科研价值，研究学者非常热衷SmallRNA的相关研究，于是对SmallRNA的测序就变成高度关注的热点。目前各个测序平台测序SmallRNA的方法，一种是通过链状的文库进行测序的，一种是进行环状文库测序的。其中，环状文库测序是将SmallRNA进行环化，形成环状文库；再以环状文库为模板生成DNA纳米球，此DNA纳米球是多拷贝的链状待测链，每一个拷贝均和环状文库互补；对这个多拷贝的链状待测链进行测序，以获得目标区域的序列。环状文库SmallRNA测序存在一个重要的缺陷就是，当多个样本混合测序时，通常会对不同样本添加不同的标签序列，由于SmallRNA本身的小片段性，仅有18-30nt，为了获得更多的数据，通常将测序读长设置为50循环；这使得进行目标片段区域测序时，大部分标签序列包括其引物区域，会被测序目标片段的新生成链覆盖，导致再进行标签序列测序时，无法结合上标签序列的引物，即不能完成标签序列的测序；这会导致两个很严重的问题，第一，因为不能完成标签序列的测序，无法区分不同的样本，所以这些数据将会被过滤弃掉，即大部分数据都是不可用数据，对测序资源造成极大浪费；第二，因为大部分数据都是不可用数据，导致不能获得较好的拆分率。因为以上问题和缺陷，目前的环状文库SmallRNA测序，如果想获得较多的数据，每次只能测序一个样本，不能多个样本混合同时进行测序。而目前的测序平台通常都具有高通量测序的能力，每次却只测序一个样本，这也会造成测序资源的极大浪费。发明内容本申请的目的是提供一种改进的用于SmallRNA的测序方法，以及该测序方法采用的测序试剂，及其应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于SmallRNA的测序方法，包括在对混合样本的环状文库进行测序时，向引物溶液中添加正常测序引物和阻断测序引物，组成混合引物，采用混合引物进行测序；其中，阻断测序引物由正常测序引物的3’末端的羟基经过化学修饰而成。需要说明的是，本申请中，正常测序引物即现有的测序平台中采用的测序引物，阻断测序引物即由正常测序引物3’末端羟基经过化学修饰而成，正常测序引物即正常的、3’末端羟基没有经过化学修饰的引物。本申请的关键在于在测序过程中同时使用常规测序引物和阻断测序引物；正常来说，如图4所示，正常测序引物的3’末端的羟基没有经过修饰的情况下，在进行合成时，正常测序引物结合到待测模板链上后，其最后一个碱基即3’末端的的羟基是暴露在外面的，会与溶液中游离dNTPs的磷酸基团发生化学反应结合在一起，具体的游离dNTPs依据与待测模板的碱基互补配对原则进行选择，新接入的dNTPs也携带一个羟基基团，与下一个dNTPs的磷酸基团结合，实现延伸；而本申请的阻断测序引物由于3’末端的羟基被化学修饰，如图5所示，因此，无法实现延伸，起到阻断测序的作用。可以理解，本申请的阻断测序引物是根据测序引物化学修饰而来的，至于具体的测序引物序列，不同的测序平台，其具体测序引物序列各不相同，但都可以采用本申请的方法进行混合样本的SmallRNA环状文库测序，因此，正常测序引物和阻断测序引物的序列在此不做具体限定。另外，化学修饰的作用是避免羟基和磷酸基团的结合，阻断延伸，因此，现有的羟基修饰方法都可以用于本申请，例如对羟基进行消除，再氢化，以H替换羟基；又如采用碱金属对羟基进行置换反应，将-OH修饰为-OY，其中Y为碱金属元素；又或者采用烃基或其它基团进行取代反应，脱水成醚；在此不做具体限定。还需要说明的是，环状文库测序的对象是DNA纳米球，而DNA纳米球是多拷贝的链状待测链，也就是说在DNA纳米球的测序模板链上存在多个正常测序引物的结合位点，当然也存在多个阻断测序引物的结合位点，而阻断测序引物的随机结合，实际上相当于占用了一个空位，因为阻断测序引物结合到测序模板链上后不会延伸，因此，不会对其后的标签序列进行覆盖，这样就保留了至少一个拷贝的标签序列，使得标签序列可以进行正常测序。因此，在采用本申请的测序方法对混合样本的环状文库进行SmallRNA测序时，可以正常的对标签序列进行测序，有效的提高数据利用率，并能够获得良好的拆分率，使得混合样本环状文库的SmallRNA测序得以实现。优选的，化学修饰包括对羟基整体或羟基中的H进行替换。需要说明的是，化学修饰的作用是将3’末端的羟基封闭，避免其与磷酸基团结合，从而达到阻断延伸的目的，因此，凡是能与羟基反应的化学修饰都可以用于本申请。优选的，阻断测序引物占所述混合引物总量的10％-70％。需要说明的是，阻断测序引物添加量越多，最终标签引物的测序数据就越多，而相应的因为阻断测序引物占用空位阻断SmallRNA目标区域的测序，SmallRNA目标区域的测序数据就越少。因此，总的来说，阻断测序引物的具体用量可以根据靶标序列的数量而定，本身存在比较多的靶标序列的情况下，可以添加更多的阻断测序引物，以获得更多的标签引物的测序数据；反之，如果靶标序列较少，为了保障SmallRNA目标区域的测序数据，则阻断测序引物的添加量就少。从这个角度来说，混合样本中各样本的数量本身要足够大，如果数量太少，则无法获得足够的SmallRNA目标区域的测序数据或标签引物的测序数据。另外，在一般情况下，阻断测序引物的用量在总混合引物的10-70％，这个范围内不会影响测序结果。本申请的另一面公开了一种用于SmallRNA的测序试剂，该测序试剂中包括阻断测序引物，其中，阻断测序引物由正常测序引物的3’末端的羟基经过化学修饰而成。需要说明的是，本申请的SmallRNA的测序方法，之所以可以实现混合样本的环状文库测序，其关键就在于阻断测序引物的使用，因此，为了使用方便，本申请单独提出了一种含有该阻断测序引物的测序试剂。同样的，阻断测序引物的关键在于3’末端的羟基经过化学修饰，而至于其具体序列，可以参考各测序平台的测序引物，其具体化学修饰也可以参考现有的羟基修饰方案，在此不做具体限定。优选的，化学修饰包括对羟基整体或羟基中的H进行替换。优选的，本申请的测序试剂中还包括正常测序引物，该正常测序引物为阻断测序引物的3’末端的羟基没有经过化学修饰的引物，阻断测序引物和正常测序引物的比例为1-7:3-9。需要说明的是，本申请的SmallRNA的测序方法，其关键在于同时添加正常测序引物和阻断测序引物，因此，为了使用方便，本申请的测序试剂中同时包含了测序引物和其相应的阻断测序引物。本申请的测序试剂中正常测序引物和阻断测序引物是相对应的，也就是说，阻断测序引物是由该正常测序引物的3’末端的羟基化学修饰而来。可以理解，本申请的测序试剂中正常测序引物和阻断测序引物，可以按照预定的比例配合，使用时直接添加引物混合液即可；也可以根据比例各自单独包装，使用时根据需求灵活的调整配比，在此不做具体限定。本申请的再一面还公开了一种用于SmallRNA的测序试剂盒，该测序试剂盒中含有本申请的测序试剂。可以理解，作为一个测序试剂盒，除了含有本申请的测序试剂以外，还可以包含其它试剂，例如测序反应的缓冲液、dNTPs等，在此不做具体限定。本申请的再一面还公开了本申请的测序试剂或本申请的测序试剂盒在小片段核酸混合样品的环状文库测序中的应用。需要说明的是，SmallRNA混合样本的环状文库，之所以无法进行测序，其关键就在于SmallRNA本身片段小，而读长大于其本身片段，以至于大部分标签序列被覆盖，而无法完成标签序列测序；基于相同的原理，本申请的测序方法、测序试剂或测序试剂盒，并不仅限于SmallRNA混合样本的环状文库的测序，其它类似情况的小片段核酸混合样品的环状文库测序也适用。可以理解，其中，小片段核酸混合样品，具体来说，就是其片段长度小于读长的小片段核酸组成的混合样品，包括但不仅限于SmallRNA。本申请的有益效果在于：本申请的SmallRNA测序方法，通过添加阻断测序引物，使得混合样本环状文库的SmallRNA测序得以实现，并且能够有效的保障标签序列的测序，进而提高了数据利用率，得到良好的拆分率。本申请的SmallRNA测序方法和测序试剂，为SmallRNA混合样本测序提供了一种新的思路和方案，解决了目前的环状文库SmallRNA测序的测序资源浪费等问题。附图说明图1是本申请实施例中各混合样本采用不同测序方法进行测序时的质量值统计结果图；图2是本申请实施例中各混合样本采用不同测序方法进行测序时的有效核苷酸序列数的统计结果图；图3是本申请实施例中各混合样本采用不同测序方法进行测序时的拆分率的统计结果图；图4是本申请中正常测序引物3’末端没有进行化学修饰的结构示意图；图5是本申请中阻断测序引物3’末端进行化学修饰后的结构示意图，其中，R为修饰基团。具体实施方式本申请的发明人经过大量的研究和试验提出，对混合样本的环状文库进行SmallRNA测序时，之所以不能很好的对标签序列进行测序，其关键在于SmallRNA的目标区域较短，而测序读长大于目标区域，以至于在设定读长下，标签序列会被覆盖，而设定的读长是为了获得更多的数据。基于以上认识，本申请的发明人创造性的提出，如果可以保留一些空位，即余量一些位置不进行目标区域的测序，则这些位置相应的标签序列就不会被覆盖，就可以正常的进行标签序列测序，从而解决标签序列测序的问题。有鉴于此，本申请的发明人进一步提出，可以在测序的时候同时添加正常测序引物和阻断测序引物，两者随机的结合到模板链上，而结合阻断测序引物的位置不会发生扩增延伸，起到占空的作用，为标签序列的测序预留空间。下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。实施例本例在华大基因自主研发的测序仪BGISEQ-500RS平台上进行SmallRNA的测序。其正常测序引物为SeqIDNo.1所示序列，SeqIDNo.1：5’-AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA-3’本例的阻断测序引物是在SeqIDNo.1所示序列的正常测序引物的基础上，于其3’末端进行化学修饰而成，本例具体的采用-H取代羟基基团，-H取代羟基基团的阻断测序引物由上海生工合成。本例采用的测序的其它试剂均来源于该测序仪配套使用的建库试剂盒以及单端上机测序试剂盒，以下简称SE50试剂盒。在验证过程中用到的测序仪、试剂操作等过程请参照BGISEQ-500RS平台的使用方法。本例采用了人、藏红花、小鼠三个来源的核酸样本，分别按照以下方式组合，组成混合样本，其中人血清分别采用了六个不同人的血清样本，所有样本由华大基因储存提供：i.第一组测试样本来源于小鼠和一号人血清的混合样本，两者按照1:1的体积比添加；ii.第二组测试样本由来源二号和三号的人血清1:1等体积混合而成，标记为人血清1；iii.第三组测试样本由来源四号和五号的人血清1:1等体积混合而成，标记为人血清2；iv.第四组测试样本来源藏红花和六号人血清的混合样本；将以上不同来源的样本，按照BGISEQ-500RS的建库方式和制备上机样品的原则进行准备。建库试剂盒采用MGIEasyDNA文库制备试剂盒，具体建库过程详见试剂盒使用说明书。在配置测序反应液时，将SE50试剂盒中的加载试剂板中的测序引物取出，替换成正常测序引物和本例的阻断测序引物的混合引物，混合引物中，原本的正常测序引物的用量占总混合引物的70％，阻断测序引物的量为总混合引物的30％。之后，按照BGISEQ-500RS准备芯片的方式进行芯片的准备，并上机测序。作为对比，对于同样的混合样本环状文库，本例直接采用正常测序引物，不添加阻断测序引物，采用相同测序平台和方法对混合样本进行测序。除了不添加阻断测序引物以外，其它条件都相同。本例分别对四组测试和四组对比的测序数据进行统计分析，比较了四组测试和四组对比的测序质量值、有效核苷酸序列数、拆分率，以上统计分析由测序平台自带的basecall软件进行。结果如图1至图3所示。图1为对四组测试和四组对比测序时的质量值统计结果图，图1中，横坐标是不同的混合样本，每个混合样本分别进行本例的测序测试和对比测序；纵坐标是每个样本不同测序方式时，获得的质量值；从图中可以看出，同一混合样本，在采用本例的测序方法时不会降低测序质量，同时不同样本间均得到同样的效果，即本例的测序方法不会影响测序结果；也就是说，阻断测序引物的添加不会影响正常的测序质量。图2为对四组测试和四组对比测序时的有效核苷酸序列数的统计结果图，图2中，横坐标是不同的混合样本，每个混合样本分别进行本例的测序测试和对比测序；纵坐标是每个样本不同测序方式时，获得的有效核酸序列数；从图中可以看出，同一混合样本在采用本例的测序方法时获得的有效核算序列数无明显差异，同时不同样本间均得到同样的效果，即本例的测序方法不会影响测序结果。图3为对四组测试和四组对比测序时的拆分情况的统计结果图，图3中，横坐标是不同的混合样本，每个混合样本分别进行本例的测序测试和对比测序；纵坐标是每个样本不同测序方式时，获得的拆分率；从图中可以看出，同一混合样本，在本例的测序方法中，由于添加了阻断测序引物，明显能够得到更高的拆分率，即可以区分出混合在一起测序的不同样本，四组混合样本都得到了更高的拆分率，有效的解决了SmallRNA混合样本测序的拆分问题。以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。SEQUENCELISTING深圳华大生命科学研究院一种用于SmallRNA的测序方法、测序试剂和应用17I248201PatentInversion3.3132DNA人工序列1aagtcggaggccaagcggtcttaggaagacaa32

权利要求：1.一种用于SmallRNA的测序方法，其特征在于：包括在对混合样本的环状文库进行测序时，向引物溶液中添加正常测序引物和阻断测序引物，采用混合引物进行测序；所述阻断测序引物由所述正常测序引物的3’末端的羟基经过化学修饰而成。2.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于：所述化学修饰包括对羟基整体或羟基中的H进行替换。3.根据权利要求1或2所述的测序方法，其特征在于：所述阻断测序引物占所述混合引物总量的10％-70％。4.一种用于SmallRNA的测序试剂，其特征在于：所述测序试剂中包括阻断测序引物，所述阻断测序引物由正常测序引物的3’末端的羟基经过化学修饰而成。5.根据权利要求4所述的测序试剂，其特征在于：所述化学修饰包括对羟基整体或羟基中的H进行替换。6.根据权利要求4或5所述的测序试剂，其特征在于：所述测序试剂中还包括正常测序引物，所述正常测序引物为所述阻断测序引物的3’末端的羟基没有经过化学修饰的引物，所述阻断测序引物和正常测序引物的比例为1-7:3-9。7.一种用于SmallRNA的测序试剂盒，其特征在于：所述测序试剂盒中含有权利要求4-6任一项所述的测序试剂。8.根据权利要求4-6任一项所述的测序试剂或权利要求7所述的测序试剂盒在小片段核酸混合样品的环状文库测序中的应用。

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