申请/专利权人：复旦大学

申请日：2021-07-06

公开（公告）日：2023-01-06

公开（公告）号：CN115572736A

主分类号：C12N15/867

分类号：C12N15/867;C12N5/10;C12N15/50;C12N7/01;C12Q1/70;C12Q1/18;A61K39/215;A61P31/14;C12R1/93

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.02.07#实质审查的生效;2023.01.06#公开

摘要：本发明属于生物医药技术领域，涉及猪流行性腹泻病毒PEDVN蛋白反式互补单轮感染系统及应用。本发明以临床分离的PEDVGII型毒株HN20的全基因组序列为基础，将PEDV全基因组序列分为A、B、C、D和E共5个片段，分别插入载体pSMART中，同时将A片段中的SapI内切酶酶切位点和E片段中的BsmBI内切酶酶切位点进行同义突变作为分子标记并删除E片段中的N基因编码框；将构建的5个重组质粒分别进行酶切，胶回收，体外连接转录后，将转录的RNA电转进稳定表达PEDVN蛋白的BHK‑21细胞中，拯救出单轮感染的PEDV病毒。本发明的PEDVN蛋白反式互补单轮感染系统，有助于PEDV的抗病毒药物、致病机制以及新型疫苗的研制。

主权项：1.猪流行性腹泻病毒PEDVN蛋白反式互补单轮感染系统，其特征在于，通过下述方法构建：1以PEDVHN20毒株的cDNA为模版，设计引物扩增PEDV-A片段、PEDV-B片段、PEDV-C片段、PEDV-D片段和PEDV-E片段；2将步骤1中的扩增的片段通过同源重组方法克隆到pSMART载体中，得重组质粒pL-A、pL-B、pL-C、pL-D、pL-E；3将重组质粒pL-A中的SapI限制性内切酶位点和重组质粒pL-E中的BsmBI限制性内切酶位点进行同义突变，并将重组质粒pL-E中的N基因编码框删除，得重组质粒m-pL-A和m-pL-E；4用SapI酶切重组质粒m-pL-A，SapI和BglI酶切重组质粒pL-B，BglI和BsaI酶切重组质粒pL-C，用BsmBI酶切重组质粒pL-D和m-pL-E，得PEDVHN20毒株全基因组中缺失N基因编码框的5个片段；5用T4DNA连接酶将A、B、C、D和E五个片段连接，得PEDVHN20毒株全基因组缺失N基因的全长cDNA克隆；6以PEDVHN20毒株的cDNA为模版，设计引物扩增PEDVN基因，通过同源重组方法克隆到pLV-IRES-puro载体中，得重组质粒pLV-PEDV-N；7将重组质粒pLV-PEDV-N和慢病毒包装质粒pMD2.G和pSPAX共转293T细胞进行慢病毒包装，将包装后的慢病毒转导BHK-21和Vero细胞，经嘌呤霉素筛选后得稳定表达PEDVN基因的细胞系BHK-21-PEDV-N和Vero-PEDV-N。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 复旦大学 猪流行性腹泻病毒（PEDV）N蛋白反式互补单轮感染系统的构建及应用

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