申请/专利权人：华中科技大学同济医学院附属同济医院

申请日：2018-03-14

公开（公告）日：2023-04-28

公开（公告）号：CN110272997B

主分类号：C12Q1/6886

分类号：C12Q1/6886;G01N33/574;A61K45/00;A61P35/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.04.28#授权;2021.03.30#实质审查的生效;2019.09.24#公开

摘要：本发明公开了一种CEBPβ基因或者蛋白的用途。所述CEBPβ基因或者蛋白在制备评估肿瘤耐药风险和或患者预后的生物标志物中的用途，所述的肿瘤为卵巢癌或者乳腺癌。本发明从新的角度研究肿瘤细胞的耐药机制，发现CEBPβ通过重编程众多耐药基因的表达从而介导化疗耐药，并且揭示了DOT1L是介导CEBPβ调控作用的组蛋白甲基转移酶。本发明为评估卵巢癌或者乳腺癌的耐药风险以及患者预后，以及针对卵巢癌或者乳腺癌药物的筛选提供了依据。为癌症，特别是卵巢癌和乳腺癌的分子靶向治疗提供了新的、更为精准的靶点，为筛选适合顺铂联合化疗的药物新型酶抑制剂奠定了基础。

主权项：1.CEBPβ基因或者蛋白和DOT1L蛋白联合作为生物标志物在制备a）肿瘤耐药风险和患者预后的诊断试剂中的用途，或b）肿瘤患者预后的诊断试剂中的用途，所述的肿瘤为卵巢癌；所述的卵巢癌为高级别浆液性卵巢癌；所述的耐药为化疗药物耐药，所述化疗药物为铂类化疗药顺铂；所述的预后与高级别浆液性卵巢癌患者的生存时间相关，所述生存时间为高级别浆液性卵巢癌患者1.8年较短的疾病无进展生存时间，高级别浆液性卵巢癌患者2.2年较短的总生存时间。

全文数据：一种CEBPβ基因或者蛋白的用途技术领域本发明属于生物医药领域，具体涉及卵巢癌耐药领域，特别涉及一种CEBPβ基因或者蛋白的用途。背景技术化疗是目前临床肿瘤治疗中最重要的手段之一，通常可在一定时间内取得较好的治疗效果。然而，在治疗过程中，肿瘤细胞逐渐产生耐药性，使化疗的效果受到很大制约。卵巢癌是致死率最高的妇科肿瘤，其起病过程隐匿，70％的患者在初次诊断时已是晚期。肿瘤细胞减灭术和术后以铂类为主的化疗是目前卵巢癌的主要治疗方案。然而，由于大多数病人最终都发展为化疗耐药，晚期卵巢癌患者的5年生存率小于30％。50多年来，卵巢癌患者的预后没有明显改善NatRevCancer,2011,1110:719-725；AnnuRevPathol,2014,9:27-45。因此，目前亟待阐明新的耐药机制和发现新的治疗靶点，从而增强化疗敏感性，提高治疗效果。耐药基因drug-resistancegenes的表达是肿瘤细胞获得耐药性的关键AnnNYAcadSci,2012,1271:58-67；YonagoActaMed,2013,562:43-50。以往研究多注重具体耐药基因的作用机制，然而，肿瘤细胞的耐药性涉及多种机制，包括转运能力增强降低细胞内药物浓度、解毒作用增强促进药物失活、DNA修复能力增强、凋亡抵抗能力增强等等YonagoActaMed,2013,562:43-50；ArchBiochemBiophys,2010,5002:116-122；CellCycle,2014,131:42-51。这种复杂的表型是由多种耐药基因决定的，因此，单一耐药基因很难成为理想的治疗靶点。能够调控多个耐药基因表达的调控因子则有可能成为理想的治疗靶点。目前尚不清楚是否存在能够调控众多耐药基因表达的关键调控因子，以及这种因子是否可能成为逆转耐药的治疗靶点。表观遗传学调控是能够同时改变众多基因表达的重要机制。表观遗传学指的是在基因序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化。在肿瘤发生发展过程中，会发生众多基因表达的变化，其机制常常与表观遗传学改变有关，如组蛋白修饰和DNA甲基化CACancerJClin,2010,606:376-392；FrontOncol,2014,4:71。组蛋白和或DNA的修饰可导致稳定性的基因表达谱变化，被称为“表观重编程”epigeneticreprogramming，是调控肿瘤表型的重要机制，如增强细胞增殖能力、侵袭能力等CACancerJClin,2010,606:376-392；Carcinogenesis.2010,311:27-36。表观遗传学调控因子能够调控众多癌基因或抑癌基因的表达，如重塑许多转移相关基因的表达，显著地改变细胞表型，从低转移表型转变为高转移表型Nature,2008,4527184:187-193。这种表观调控因子的作用非常关键，因而产生了以此类因子为靶点的“表观治疗”epigenetictherapy策略JClinOncol,2009,2732:5410-5417；JClinInvest.2015,1253:1043-1055；InvestNewDrugs,2014,323:526-534；CancerDiscov,2013,39:1002-1019。肿瘤细胞耐药性也涉及到众多基因的表达变化，但目前尚未揭示能够同时调控多个耐药基因表达的重编程机制。因此，找到这种关键调控因子对于化疗耐药的研究和肿瘤的靶向治疗具有重要的意义，特别是卵巢癌和乳腺癌。发明内容本发明所要解决的技术问题是为克服现有技术中针对肿瘤治疗过程中易出现耐药性以及预后差等现象缺乏可用于评估肿瘤耐药性、预后的标志物，并且进一步地缺乏抗肿瘤药物的缺陷，提供一种CEBPβ基因或者蛋白的用途。为评估卵巢癌或者乳腺癌的耐药风险以及患者预后，以及针对卵巢癌或者乳腺癌药物的筛选提供了依据；为恶性肿瘤例如癌症，特别是卵巢癌和乳腺癌的分子靶向治疗提供了新的、更为精准的靶点，为筛选适合顺铂联合化疗的药物新型酶抑制剂奠定了基础。以往关于表观关键调控因子的研究主要集中于表观调控酶。然而，仅仅只有数个，有时只有一个酶催化某一修饰位点。因此，靶向这种调控全基因组所有基因的表观修饰酶往往是不精准的。关于酶的协同因子及其时空特异性和或基因序列特异性的调控机制是该领域的关键问题，也是难点问题。本发现揭示了表观遗传学调控在肿瘤耐药及其逆转中的作用，证明了CEBPβ可作为卵巢癌铂类耐药和预后评估的生物标志物。而且本发现提示：除表观修饰酶之外，CEBPβ这类酶的协同因子可能作为分子靶向治疗中更加精准的新靶点。本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题：本发明提供一种CEBPβ基因或者蛋白在制备评估肿瘤耐药风险和或患者预后的生物标志物中的用途，所述的肿瘤为卵巢癌或者乳腺癌。本发明中所述的耐药可为本领域常规的概念，指的是机体对药物反应性降低，优选为化疗药物耐药，所述化疗药物优选为铂类化疗药例如临床常用的顺铂、卡铂等，本发明选择顺铂为例来说明。若没有特殊说明，本发明所述的卵巢癌可为本领域常规的卵巢癌，优选为浆液性卵巢癌，特别是高级别浆液性卵巢癌。本发明还提供一种CEBPβ基因或者蛋白在制备肿瘤耐药或者患者预后的诊断试剂中的用途，所述的肿瘤为卵巢癌或者乳腺癌。如上所述，所述的耐药为化疗药物耐药，所述化疗药物优选为铂类化疗药例如顺铂；所述的卵巢癌优选为浆液性卵巢癌，特别是高级别浆液性卵巢癌。根据本发明，所述的患者预后优选为卵巢癌或者乳腺癌患者生存时间相关，更优选为卵巢癌患者较短的疾病无进展生存时间PFS1.8年，p＝8.65×10-17，及较短的总生存时间2.2年，p＝1.17×10-4。本发明还提供一种靶向CEBPβ或CEBPβ下游信号的抑制剂、或者靶向CEBPβ蛋白与H3K79组蛋白甲基化转移酶相互作用的拮抗剂在制备抗卵巢癌或者乳腺癌的药物中的用途。其中，所述的CEBPβ基因或者蛋白优选作为逆转肿瘤耐药性的分子靶点。所述的抑制剂可为本领域常规的、用于抑制或者靶向CEBPβ或CEBPβ下游信号的核酸序列或者蛋白，优选为直接靶向CEBPβ基因或者蛋白、或者CEBPβ下游信号的siRNA、shRNA或抗体，所述CEBPβ下游信号优选自下述一种或多种：EGFR、RICTOR、HIF1A、ABCC3、G2E3、NIPBL、NEIL3、ROCK1、多药耐药相关蛋白1[MRP1ABCC1]以及BRCA1通路，所述的H3K79组蛋白甲基转移酶优选为DOT1L蛋白；较佳地，所述的药物还包括铂类化疗药例如顺铂作为活性成分。本发明还提供一种CEBPβ基因作为抗卵巢癌或者乳腺癌药物的筛选标记的用途。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明从新的角度研究肿瘤细胞的耐药机制，发现CEBPβ通过重编程众多耐药基因的表达从而介导化疗耐药，并且揭示了DOT1L是介导CEBPβ调控作用的组蛋白甲基转移酶。本发明为评估卵巢癌或者乳腺癌的耐药风险以及患者预后，以及针对卵巢癌或者乳腺癌药物的筛选提供了依据；为癌症，特别是卵巢癌和乳腺癌的分子靶向治疗提供了新的、更为精准的靶点，为筛选适合顺铂等铂类药物联合化疗的药物新型酶抑制剂奠定了基础。附图说明图1为利用上皮性标志物EPCAM分选获得高纯度的肿瘤细胞和正常上皮细胞。图2为H3K9和H3K79位点的组蛋白甲基化水平在高级别浆液性卵巢癌中显著增高。图3为浆液性卵巢癌的组蛋白甲基化与基因表达的关系。图4为筛选调控组蛋白甲基化的位点特异性转录因子。图5为CEBPβ在卵巢癌中高表达并与患者的预后差有关。图6为CEBPβ在卵巢癌细胞系中的表达水平与细胞的铂类耐药程度密切相关。图7为CEBPβ促进卵巢癌铂类耐药。图8为CEBPβ通过调控H3K79甲基化重编程基因表达。图9为通过募集组蛋白甲基转移酶DOT1L，CEBPβ促进其靶基因的H3K79甲基化。图10为CEBPβ促进卵巢癌铂类耐药的作用依赖于DOT1L。图11为CEBPβ下游基因的整合通路分析。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例1过表达CEBPβ可降低细胞对顺铂的敏感性，抑制CEBPβ表达则增加细胞对顺铂的敏感性1、甲基化分析浆液性卵巢癌是最常见、恶性程度最高的卵巢癌。浆液性卵巢癌的组织起源是输卵管上皮。选用上皮性标志物EPCAM、采用磁珠分选方法分别纯化了正常输卵管、高级别浆液性卵巢癌HG-SOC和低级别浆液性卵巢癌LG-SOC的标本图1，对6个主要的组蛋白甲基化位点H3K4、H3K9、H3K27、H3K36、H3K79和H4K20进行了分析。采用染色质免疫共沉淀结合高通量测序ChIP-Sequencing，分析了各组标本的组蛋白甲基化程度。结果显示，HG-SOC以H3K4me3、H3K9me3和H3K79me3增高为主，而LG-SOC在各个位点上的甲基化程度变化很小图2，图3A、3B。同时采用RNA-Sequencing分析了各组之间表达水平存在显著差异的基因。ChIP-Sequencing联合RNA-Sequencing的结果显示，HG-SOC中许多基因的表达上调与H3K4me3和H3K79me3水平增高有关图3C，许多基因表达的下调主要与H3K9me3水平增高有关图3D；而LG-SOC中大部分基因表达水平的变化都与组蛋白甲基化程度无关图3C和3D。因此，组蛋白的H3K4、H3K9和H3K79甲基化修饰在高级别浆液性卵巢癌的基因表达调控中起重要作用。2、甲基化修饰的机制研究组蛋白的甲基化修饰可由多种复杂机制进行控制，其中很重要的一种机制是通过位点特异性的转录因子募集组蛋白甲基转移酶，从而使该转录因子的靶基因发生组蛋白甲基化修饰。本发明着重分析了组蛋白H3K4、H3K9和H3K79甲基化水平增高的基因，采用基序分析motifanalysis策略对这些基因的序列进行位点特异性转录因子的结合预测。结果显示，在H3K4甲基化水平增高的基因中，有13个基序显著富集，在H3K9、H3K79甲基化水平增高的基因中，分别有9个、15个基序显著富集；与这37个基序结合的转录因子有35个，均已鉴定图4A。这些转录因子结合的基序在基因序列中富集，提示这些转录因子很可能参与卵巢癌中组蛋白甲基化修饰的调控。利用癌症基因组图谱计划TCGA；Nature.2011；4747353:609-15数据库中HG-SOC的数据，进一步通过生存分析来确定上述35个候选转录因子对病人预后的影响。用每个基因的表达水平中位数作为阈值，将患者分成基因-高表达组及基因-低表达组，比较两组间的预后差异。Kaplan-Meier生存分析的结果显示，CEBPβ高表达组病人的总生存OS；图4B左图和疾病无进展生存PFS；图4B右图显著较差。更重要的是，转录因子在肿瘤中表达水平变化与预后联合分析的汇总结果显示，在35个候选转录因子中，CEBPβ是唯一一个与HG-SOC的总生存和疾病无进展生存都有关的因子图4C。采用免疫组化分析了20个正常输卵管、20个正常卵巢上皮和245个高级别浆液性卵巢癌HG-SOC病人的标本，并且对卵巢癌病人进行预后随访。结果显示，CEBPβ的蛋白水平在正常组织中很低，而在高级别浆液性卵巢癌中明显增高图5A。CEBPβ蛋白水平的高表达与卵巢癌患者较短的疾病无进展生存时间PFS，图5B及较短的总生存时间OS，图5C有关。采用蛋白印迹检测CEBPβ在多个卵巢癌细胞系中的蛋白水平，结果显示，CEBPβ蛋白水平在多种卵巢癌细胞系中明显增高，OV2008是顺铂敏感细胞，C13*是OV2008衍生的顺铂耐药细胞CancerRes.2001；615:1862-8；Cancercellinternational2009,9:4，各细胞系之间顺铂耐药程度的差异与CEBPβ表达水平密切相关图6。TCGAmRNA水平以及免疫组化的数据分析蛋白水平显示，CEBPβmRNA或蛋白高表达的HG-SOC病人发生顺铂耐药的比例都明显增高图7A。在OV2008细胞中过表达了CEBPβ，并采用shRNAshCEBPβ_1,5′-TGCCTTTAAATCCATGGAA-3′；shCEBPβ_2,5′-ACTTCCTCTCCGACCTCTT-3′在C13*细胞中沉默CEBPβ的表达图7B确定了CEBPβ在顺铂耐药中的作用：过表达CEBPβ可降低细胞对顺铂的敏感性，抑制CEBPβ表达则增加细胞对顺铂的敏感性图7C-7i。实施例2CEBPβ对铂类耐药的促进作用是由DOT1L所介导的，CEBPβ-DOT1L可作为分子靶向治疗中的新靶点。1、CEBPβ能够促进H3K79甲基化采用H3K79甲基化抗体做ChIP-Sequencing分析，结果显示沉默CEBPβ使C13*细胞的整体H3K79甲基化水平降低图8A。同时本发明用CEBPβ抗体做ChIP-Sequencing鉴定了的CEBPβ靶基因。CEBPβ靶基因与沉默CEBPβ后H3K79甲基化水平降低的基因有显著的关联性图8B，8C。由于H3K79甲基化增高促进基因表达NatRevMolCellBiol.2005；611:838-49，本发明采用RNA-Sequencing分析了CEBPβ调控的基因图8D-8F。最后汇总分析了沉默CEBPβ引起的H3K79甲基化改变和基因表达水平改变，鉴定了沉默CEBPβ后数百个H3K79甲基化降低并且表达水平降低的CEBPβ靶基因图8G，其中有9个图8G中指出的是卵巢癌中已知的铂类耐药基因，另有21个基因在功能上可能与铂类耐药有关图8H。2、CEBPβ调控DOT1L介导的H3K79甲基化DOT1L是唯一已知的H3K79甲基转移酶，而CEBPβ是一个没有酶活性的DNA结合蛋白GenesDev.2011；2513:1345-58。用DOT1L抗体ab72454；购自Abcam做ChIP-Sequencing鉴定了的DOT1L靶基因。CEBPβ靶基因与DOT1L靶基因之间有极为显著的关联性图9A，并且许多CEBPβ结合位点与DOT1L结合位点非常接近图9B，9C。免疫共沉淀实验证明CEBPβ与DOT1L有直接的相互作用图9D；ChIP-reChIP实验证明CEBPβ与DOT1L能相互作用并共同结合与靶基因图9E。进一步，沉默CEBPβ可以降低DOT1L与靶基因的结合能力采用DOT1L抗体做ChIP-Sequencing和ChIP-qPCR证明，图9F-9H。与此相一致，沉默DOT1L可以消除CEBPβ过表达对基因表达的促进作用。因此，CEBPβ与DOT1L结合并增强其与DNA结合的能力，从而调控H3K79甲基化。3、CEBPβ介导的铂类耐药依赖于其调控H3K79的作用采用shRNAshDOT1L-1,5′-GAGTGTTATATTTGTGAAT-3′；shDOT1L-2,5′-CACCTCTGAACTTCAGAAT-3′沉默肿瘤细胞中DOT1L表达：DOT1LshRNA能消除CEBPβ过表达对OV2008细胞耐药的促进作用；相似的，当DOT1L被沉默时，沉默CEBPβ不能进一步降低C13*细胞的铂类耐药性图10A。为了进一步明确DOT1L是否介导了CEBPβ对耐药表型的作用，通过文献检索分析了CEBPβ-DOT1L共同靶基因的下游功能，并且发现其中很多基因可能与铂类耐药有关。为了在卵巢癌模型中验证这点，本发明在SKOV3细胞系购买自TCGA细胞库中用shRNA逐个沉默相应基因的表达。除了9个已知的铂类耐药基因之外，鉴定出14个促进卵巢癌铂类耐药的新基因图10B。这23个基因可能通过多条途径促进铂类耐药，大致可以分为三个方面：1促进药物转导，2增强DNA损伤修复，和3调节信号通路增强细胞存活能力。与此相一致，沉默CEBPβ产生对JAK-STAT、PI3K-AKT和MAPK信号通路的广泛抑制图10C，沉默CEBPβ或DOT1L也可以增强铂类药物引起的DNA损伤碱性彗星实验，图10D并提高细胞内药物的累积罗丹明药物积累试验，图10E。DOT1LshRNA能消除CEBPβ过表达对DNA损伤修复图10D、药物转导图10E和存活通路图10F和10G的促进作用。相似的，当DOT1L被沉默时，沉默CEBPβ不能进一步降低DNA损伤修复图10D和药物转导能力图10E。这些结果证明CEBPβ对铂类耐药的促进作用是由DOT1L所介导的。最后发现，相对于顺铂单药治疗，联合DOT1L抑制剂SGC0946、EPZ004777和顺铂可以明显延长小鼠的生存时间。此外，CEBPβ增强顺铂耐药的作用与BRCA介导的DNA损伤修复能力密切相关图11。除卵巢癌之外，BRCA通路突变在乳腺癌铂类耐药中也起到重要作用FrontOncol.2018；5；8:16，因此CEBPβ在乳腺癌的铂类耐药中也可能存在很好的临床应用前景。

权利要求：1.CEBPβ基因或者蛋白在制备评估肿瘤耐药风险和或患者预后的生物标志物中的用途，所述的肿瘤为卵巢癌或者乳腺癌。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的耐药为化疗药物耐药，所述化疗药物优选为铂类化疗药例如顺铂；和或，所述的卵巢癌为高级别浆液性卵巢癌；和或，所述的预后为卵巢癌或者乳腺癌患者生存时间相关，优选为卵巢癌患者较短的疾病无进展生存时间为1.8年，卵巢癌患者较短的总生存时间为2.2年。3.CEBPβ基因或者蛋白在制备肿瘤耐药或者患者预后的诊断试剂中的用途，所述的肿瘤为卵巢癌或者乳腺癌。4.如权利要求3所述的用途，特征在于，所述的耐药为化疗药物耐药，所述化疗药物优选为铂类化疗药例如顺铂；和或，所述的卵巢癌为高级别浆液性卵巢癌；和或，所述的预后为卵巢癌或者乳腺癌患者生存时间相关，优选为卵巢癌患者较短的疾病无进展生存时间为1.8年，卵巢癌患者较短的总生存时间为2.2年。5.靶向CEBPβ或CEBPβ下游信号的抑制剂、或者靶向CEBPβ蛋白与H3K79组蛋白甲基化转移酶相互作用的拮抗剂在制备抗卵巢癌或者乳腺癌的药物中的用途。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的CEBPβ基因或者蛋白作为逆转肿瘤耐药性的分子靶点。7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的卵巢癌为高级别浆液性卵巢癌。8.如权利要求5～7任一项所述的用途，其特征在于，所述的抑制剂为直接靶向CEBPβ基因或者蛋白、或者CEBPβ下游信号的siRNA、shRNA或抗体，所述CEBPβ下游信号优选自下述一种或多种：EGFR、RICTOR、HIF1A、ABCC3、G2E3、NIPBL、NEIL3、ROCK1、多药耐药相关蛋白1MRP1ABCC1以及BRCA1通路，所述的H3K79组蛋白甲基转移酶优选为DOT1L蛋白；较佳地，所述的药物还包括铂类化疗药例如顺铂作为活性成分。9.CEBPβ基因作为抗卵巢癌或者乳腺癌药物的筛选标记的用途。10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的卵巢癌为高级别浆液性卵巢癌。

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