申请/专利权人：贵州师范大学;赤水桫椤国家级自然保护区管理局

申请日：2022-12-01

公开（公告）日：2023-07-21

公开（公告）号：CN115623987B

主分类号：A01H4/00

分类号：A01H4/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.07.21#授权;2023.02.14#实质审查的生效;2023.01.20#公开

摘要：本发明公开了一种以桫椤孢子萌发诱导绿色球状体（GreenGlobularBodies，GGB）途径组培快繁的方法，该方法包括桫椤无菌孢子的获取、桫椤孢子诱导配子体、桫椤GGB诱导增殖、桫椤GGB分化、桫椤孢子体生根、桫椤再生植株驯化、练苗和移栽。本发明中GGB的诱导率100%、GGB分化率92%、生根率100%、桫椤再生植株成活率100%。本发明技术与传统播种繁殖相比，具有萌发率高、繁殖周期短和成活率高等特点。此发明实现了濒危物种桫椤的组培快繁；对我国珍稀植物桫椤种质资源扩繁、离体保存、濒危程度的缓解、维持种群生态平衡以及其野生资源可持续发展利用具有重要意义。

主权项：1.一种桫椤孢子诱导绿色球状体途径植物组织培养的方法，其特征在于：所述方法是先获取桫椤无菌孢子，将桫椤无菌孢子诱导成配子体，再进行桫椤GGB的诱导增殖、桫椤GGB分化诱导、桫椤孢子体生根诱导、桫椤再生植株驯化炼苗和移栽；所述方法包括以下步骤：（1）桫椤无菌孢子获取：取成熟的桫椤孢子置于离心管中，加入50mL的蒸馏水浸泡12h，4500rmin条件下离心机离心4min，移液枪去除上清液，在超净工作台上用40-50mL的75%酒精消毒30s，静置90s，待孢子上下分层，去除上清液，用无菌水清洗3次，再用40-50mL的4%NaClO溶液消毒，摇晃离心管4min后静置分层，去除上清液，用无菌水清洗7-8次，再加入20-30mL无菌水，制成无菌孢子悬浮液；（2）桫椤孢子诱导配子体：将无菌孢子悬浮液接种于诱导配子体培养基上，在温度25±2℃、湿度80±2%、光质为白光、光周期12hd和光照强度为3000Lux的培养条件下，培养2个月，得到配子体；诱导配子体培养基是由18MS+0.5mgL的6-BA+0.1mgL的2,4-D+20gL蔗糖+16gL琼脂组成，再使用1molLNaOH和1molLHCl调至pH为5.80；18MS是由0.125份大量元素、1份铁盐、1份微量元素和1份有机物制成；所述大量元素是由1650mgL硝酸铵+1900mgL硝酸钾+440mgL氯化钙+370mgL硫酸镁+170mgL磷酸二氢钾而制成；所述铁盐是由27.85mgL硫酸亚铁+37.25mgL乙二胺四乙酸二钠而制成；所述微量元素是由0.83mgL碘化钾+6.2mgL的硼酸+22.3mgL硫酸锰+8.6mgL硫酸锌+0.25mgL钼酸钠+0.025mgL硫酸铜+0.025mgL氯化钴而制成；所述有机物是由100mgL肌醇+0.5mgL烟酸+0.5mgL盐酸吡哆醇+0.1mgL盐酸硫胺素+2mgL甘氨酸而制成；（3）桫椤GGB的诱导增殖：将配子体切割成4×4mm的方块，接种的配子体的初始鲜重0.08-0.12g，接种在诱导增殖GGB培养基上，在温度25±2℃、湿度80±2%、光质为白光、光周期12hd和光照强度为3000Lux的培养条件下，培养2个月，得到桫椤GGB；所述诱导增殖GGB培养基是由12MS+0.3mgL的6-BA+0.4mgL的NAA+30gL蔗糖+6gL的琼脂组成，再使用1molL的NaOH和1molL的HCl调至pH值为5.80；（4）桫椤GGB分化诱导：将桫椤GGB每隔15天，喷洒一次无菌水，促进桫椤GGB受精，继续培养30天后，将桫椤GGB分割为直径的1-1.5cm的小球，接种到GGB分化诱导培养基中,在温度25±2℃、光质为白光、光周期12hd和光照强度为3000Lux的培养条件下，培养2个月后，得到孢子体；GGB分化诱导培养基是由12MS+0.３mgL的KT+0.4mgL的IBA+30gL蔗糖+6gL琼脂组成，再使用1molLNaOH和1molLHCl调至pH为5.80；（5）桫椤孢子体生根诱导：取孢子体转接至生根诱导培养基诱导其生根，在温度25±2℃、光质为白光、光周期12hd和光照强度为3000Lux的培养条件下，培养1个月，得到桫椤再生植株；生根诱导培养基为：12MS+0.7mgL的IAA+30gL蔗糖+6gL琼脂，再使用1molLNaOH和1molLHCl调至pH为5.80；（6）桫椤再生植株驯化、炼苗和移栽：选取苗高达到5-10cm的桫椤再生植株在人工气候室驯化、炼苗后移栽至不同的基质中，在温度25±2℃，湿度89±2%，光质为白光，光周期16hd，培养1个月移栽到大棚进行常态化管理。

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