申请/专利权人：南通市肿瘤医院(南通市第五人民医院)

申请日：2023-03-14

公开（公告）日：2023-08-08

公开（公告）号：CN116555276A

主分类号：C12N15/12

分类号：C12N15/12;C12N15/85;A01K67/027

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的撤回

法律状态：2024.02.09#发明专利申请公布后的撤回;2023.08.25#实质审查的生效;2023.08.08#公开

摘要：本申请提出了一种基因敲除选育fkbp10a基因缺失型斑马鱼的方法，涉及基因敲除技术领域。根据CRISPRCas敲除原理，设计一对fkbp10a基因的靶位点，其中引物的碱基序列分别如SEQIDNO：1‑2所示；体外合成sgRNA；将Cas9protein和sgRNA配成混合液，充分混匀，注射混合液于一细胞期的受精卵内；对长大的斑马鱼进行剪尾鉴定，确定了斑马鱼突变体F0代，将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，筛选F1代突变体；从F1代突变体中挑选具有相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，Sanger测序检验，得到fkbp10a突变体纯合子。其操作简单，脱靶率低。

主权项：1.一种基因敲除选育fkbp10a基因缺失型斑马鱼的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、CRISPRCas9基因敲除靶位点进行设计：查询斑马鱼fkbp10a基因的基因组DNA序列及其功能结构域，根据CRISPRCas敲除原理，设计一对fkbp10a基因的靶位点，其中引物的碱基序列分别为SEQIDNO：1-2所示的上游核苷酸序列以及下游核苷酸序列；S2、体外合成sgRNA；S3、斑马鱼胚胎的显微注射：在进行显微注射之前，将Cas9protein和sgRNA配成混合液，充分混匀，注射Cas9protein和sgRNA混合液于一细胞期的受精卵内，进行孵化；S4、在显微镜下观察胚胎表型，筛选正常发育的胚胎，采用Sanger测序检测靶位点的有效性；S5、在胚胎注射两个月之后，对长大的斑马鱼进行剪尾鉴定；S6、目的序列的TA克隆：经过初步Sanger测序鉴定显示有突变的斑马鱼个体，接下来进行TA克隆之后挑取单克隆作进一步检测；S7、菌液Sanger测序：根据测序之后给出的单峰图和序列，在NCBI上与标准目的序列进行对比，根据比对结果，分析出每个单克隆的突变类型；S8、获得可遗传的斑马鱼突变体的F1代：通过筛选确定了斑马鱼突变体F0代，将F0代突变体分别与野生型斑马鱼杂交得到F1代胚胎，受精两天后，每个突变体F1代分别取多个胚胎进行突变遗传性鉴定；将每个胚胎单独提取基因组，然后通过PCR扩增出418bp的靶位点附近区域，部分进行测序；如果从F1代胚胎中检测到存在突变，则将斑马鱼突变体的F1代养大至2-3个月；再分别对每条F1代斑马鱼成鱼进行剪尾鉴定，筛选F1代突变体；S9、获得斑马鱼突变体的F2代纯合子：从F1代突变体中挑选具有相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F2代，受精四天后取部分胚胎进行鉴定，对每个胚胎单独提取基因组，PCR扩增出418bp靶位点附近区域，Sanger测序，初步检验是否可以得到fkbp10a突变体纯合子；S10、Sanger测序结果证明存在纯合子的个体养大至3个月单条剪尾进行鉴定，得到这种新的斑马鱼fkbp10a等位基因缺失品系。

全文数据：

权利要求：

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