申请/专利权人：北京齐禾生科生物科技有限公司

申请日：2021-03-04

公开（公告）日：2023-08-15

公开（公告）号：CN112941100B

主分类号：C12N15/82

分类号：C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/46;C12Q1/6895;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.08.15#授权;2021.07.02#实质审查的生效;2021.06.11#公开

摘要：本发明提供了一种中间偃麦草遗传转化方法。申请人筛选了1000个中间偃麦草的品种，挑选出一个组培效应好的品种，进行了基因枪转化体系的建立。本发明的方法利用偃麦草的胚性愈伤组织进行基因枪轰击，通过组织培养条件以及转化流程的优化调整，大大缩短了转化周期，降低了体细胞变异以及逃逸现象的发生。

主权项：1.一种中间偃麦草遗传转化方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、将中间偃麦草的愈伤组织接种至分化培养基上分化培养至长出丛生芽，切下丛生芽的分生组织接种至诱导培养基上诱导培养，得到胚性愈伤组织；S2、将步骤S1得到的胚性愈伤组织接种至高渗培养基上进行轰击前高渗处理；所述高渗培养基为以MS基本培养基为基础培养基，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为22.6μM、蔗糖的浓度为150gL、植物凝胶的浓度为3gL，pH值为5.8的培养基；S3、将含有目的基因的重组载体以基因枪轰击步骤S2处理后的胚性愈伤组织；S4、将步骤S3基因枪轰击后的胚性愈伤组织接种至所述高渗培养基上进行轰击后高渗处理；S5、将步骤S4高渗处理后的胚性愈伤组织先后转至筛选培养基上进行筛选培养，得到抗性愈伤组织；S6、将步骤S5诱导出的抗性愈伤组织转至再生培养基上再生培养至长出的绿头或绿苗；S7、将S6长出的绿头或绿苗继代至生根培养基上，培养得到转化植株；针对目的基因设计引物对，以所述引物对PCR扩增转化植株的DNA，筛选得到转基因阳性中间偃麦草；S8、壮苗及扩繁生长；所述诱导培养基为以MS基本培养基为基础培养基，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为22.6μM、五水硫酸铜的含量为0.6mgL、水解酪蛋白的浓度为1gL、蔗糖的浓度为30gL、植物凝胶的浓度为3gL，pH值为5.8的培养基；所述分化培养基为以MS基本培养基为基础培养基，麦芽糖的浓度为30gL、6-苄氨基腺嘌呤的浓度为8.9μM、植物凝胶的浓度为3gL，pH值为5.8的培养基；所述筛选培养基为筛选培养基I和筛选培养基II；所述筛选培养基I为以MS基本培养基为基础培养基，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为22.6μM、五水硫酸铜的含量为0.6mgL、水解酪蛋白的浓度为1gL、蔗糖的浓度为30gL、硝酸银的浓度为10mgL、潮霉素的浓度为50mgL、植物凝胶的浓度为3gL，pH值为5.8的培养基；所述筛选培养基II为以MS基本培养基为基础培养基，2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为22.6μM、五水硫酸铜的含量为0.6mgL、水解酪蛋白的浓度为1gL、蔗糖的浓度为30gL、硝酸银的浓度为10mgL、潮霉素的浓度为75mgL、植物凝胶的浓度为3gL，pH值为5.8的培养基；所述再生培养基为以MS基本培养基为基础培养基，麦芽糖的浓度为30gL、6-苄氨基腺嘌呤的浓度为8.9μM、潮霉素的浓度为50mgL、植物凝胶的浓度为3gL，pH值为5.8的培养基；所述生根培养基为以12MS基本培养基为基础培养基，蔗糖的浓度为30gL、植物凝胶的浓度为3gL，pH值为5.8的培养基；S1中所述分化培养，培养条件是24℃光照条件；S1中所述诱导培养、S2中所述轰击前高渗处理、S4中所述轰击后高渗处理、S5中所述筛选培养，培养条件均为24℃黑暗条件；S6中所述再生培养，培养条件是温度24℃，光周期为16h8h，光照强度150μmolm2s。

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