申请/专利权人：复旦大学附属中山医院

申请日：2023-06-07

公开（公告）日：2023-09-19

公开（公告）号：CN116769720A

主分类号：C12N5/10

分类号：C12N5/10;A61K39/00;A61K38/19;A61K38/20;A61P35/00;C12N15/62;C12N15/867

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.10.10#实质审查的生效;2023.09.19#公开

摘要：本发明公开了一种靶向GPC3且高表达CCL‑19的四代CART细胞及其制备方法与应用。本发明根据GPC3单克隆抗体的氨基酸序列，按照VL‑Linker‑VH方式拼接成scFv，并根据密码子偏爱性转换为核苷酸序列，同时5’端加入BamHI酶切位点和信号肽，3’端加入NheI酶切位点，之后进行全基因合成，然后，CAR载体通过病毒转染进入到T淋巴细胞内。本发明针对肿瘤细胞具有免疫逃逸的特性，将高特异性GPC3抗体的单链可变区融合构建入CAR载体，能够更特异性识别和杀伤GPC3阳性表达的肝癌细胞；通过调整合适长度且灵活性的铰链区，保障CART的有效杀伤性；同时，高表达CCL‑19具有更强的活性。

主权项：1.一种靶向GPC3且高表达CCL-19的四代CART细胞，其特征在于，所述CART细胞通过以下步骤获得：步骤1：从GPC3抗体杂交瘤细胞中提取RNA，经过反转录PCR获得cDNA，并通过核苷酸沉淀法纯化产物；步骤2：利用cDNA为模板，扩增出GPC3单克隆抗体的VH和VL基因；步骤3：LV载体通过限制性内切酶BamHI和NheI酶切获得CAR载体质粒，再与目的基因片段VH和VL基因连接，再通过源于口蹄疫病毒的自剪切多肽2A片段将IL-7及CCL-19元件构建入CAR载体中，获得含有GPC3单克隆抗体的VH和VL可变区的目的质粒；步骤4：将目的质粒转化扩增，通过慢病毒包装系统进行病毒包装，制备成病毒液，将制备好的慢病毒液体进行浓缩、纯化，以保证一定的病毒滴度；步骤5：采用免疫磁珠法从人外周血单个核细胞中进行T细胞分选，然后来进行T细胞的激活、扩增及慢病毒转染T细胞；T细胞的激活采用含IL-2和rhIL-15细胞因子的血清培养基培养，并在转染后的第二天以及每传代一次的培养体系中需添加IL-2和rhIL-15细胞因子。

全文数据：

权利要求：

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