申请/专利权人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所

申请日：2023-07-24

公开（公告）日：2023-10-13

公开（公告）号：CN116875738A

主分类号：C12Q1/6897

分类号：C12Q1/6897

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.10.31#实质审查的生效;2023.10.13#公开

摘要：本发明涉及一种鉴定牛TDP‑43基因启动子活性区域的方法，包括以下步骤：1牛TDP‑43基因启动子的克隆；2牛TDP‑43启动子5’端系列缺失片段荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定；3牛TDP‑43基因启动子系列缺失片段转录活性分析及核心启动子区确定；4牛TDP‑43核心启动子区转录因子结合位点预测及筛选。通过本发明，为进一步筛选调控牛TDP‑43基因表达的转录因子、研究调控TDP‑43基因转录的具体机制提供了一种便捷高效的方法。

主权项：1.一种鉴定牛TDP-43基因启动子活性区域的方法，其特征在于，包括如下步骤：1克隆牛TDP-43基因启动子片段：依据牛TDP-43基因参考序列，设计引物扩增该基因5’端上游2000bp左右的启动子片段，并进行TA克隆构建牛TDP-43启动子片段的克隆载体；2构建牛TDP-43基因启动子5’端系列缺失片段的荧光素酶报告基因载体：a.首先设计5’端系列缺失片段的扩增引物：固定TDP-43基因启动子下游引物，综合考虑引物设计对序列的要求和TDP-43基因启动子序列特征，使上述TDP-43基因启动子5’端每次截短250～400bp左右，设计上游引物，并在上、下游引物序列5’端添加酶切位点；b.以上述1中的克隆载体菌液为模板，加入a中所述的扩增引物进行PCR扩增得到5’端系列缺失片段；c.回收b中5’端系列缺失片段并与pGL3-Basic连接，经转化感受态菌、挑单克隆摇菌后提取质粒；通过双酶切和测序鉴定获得该5’端系列缺失片段的重组载体；3分析牛TDP-43基因启动子系列缺失片段的活性并鉴定核心启动子区：将2构建的5’端系列缺失片段的重组载体与内参质粒pRL-TK共转染奶牛乳腺上皮细胞系MAC-T，通过检测双荧光素酶活性分析所述5’端系列缺失片段的转录活性，确定核心启动子区；4牛TDP-43基因核心启动子区转录因子的筛选：利用在线软件AnimalTFDB4和TRANSFAC2.0预测分析牛TDP-43启动子区转录因子结合位点，从中筛选调控乳脂代谢相关转录因子结合位点。

全文数据：

权利要求：

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