申请/专利权人：昆明医科大学

申请日：2022-06-13

公开（公告）日：2024-02-02

公开（公告）号：CN114990160B

主分类号：C12N15/85

分类号：C12N15/85;C12N9/22;C12N15/113;C12N15/89;C12N15/12;A01K67/0275;A61K49/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.02#授权;2022.09.20#实质审查的生效;2022.09.02#公开

摘要：本发明公开了一种Navβ2‑ICD低表达转基因鼠模型的构建方法及其应用，包括如下步骤：1设计gRNA靶向载体和供体寡核苷酸；2构建pCRISPR‑gRNA载体；3将构建好的质粒载体转入菌种进行DNA的提取；4寡核苷酸序列的合成、鉴定、纯化，备用；5显微注射液制备；6用显微注射法制作转基因小鼠；PCR鉴定阳性转基因鼠；7利用特异引物通过PCR法进行检测；8建立Navβ2‑ICD低表达转基因鼠模型。本发明解决了现有BACE1及PSγ‑secretase抑制剂的应用副作用较大且底物靶点广泛的缺陷，避免了酶解底物抑制剂应用造成的其他广泛副作用。

主权项：1.一种Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型的构建方法，其特征在于包括如下步骤：（1）设计pCRISPR-gRNA载体和供体寡核苷酸：gRNA的正向链的基因序列为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列；gRNA的反向链的基因序列为SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；供体寡核苷酸序列为SEQIDNo.5所示的核苷酸序列；供体寡核苷酸p.V173AGTC-GCC和p.L175KTTG-AAG通过同源性定向修复被引入第4外显子：设计Navβ2上PSγ-secretase的酶解位点V173A及V175K点突变，SCN2B基因位于小鼠9号染色体上，共鉴定出4个外显子，ATG起始密码子在外显子1，TAA终止密码子位于外显子4，靶点的酶解位点p.V173及p.L175均位于第4外显子；（2）构建pCRISPR-gRNA载体；（3）将构建好的pCRISPR-gRNA载体转入菌种进行DNA的提取，通过大量制备质粒DNA，电泳、用凝胶回收试剂盒回收DNA片断，凝胶柱纯化DNA，并用TE溶液对DNA进行溶解回收；（4）供体寡核苷酸序列的合成、鉴定、纯化，备用；（5）显微注射液制备；（6）将构建好的pCRISPR-gRNA载体以及供体寡核苷酸线性化，用显微注射法制作转基因小鼠；（7）PCR法鉴定阳性转基因鼠，转基因小鼠在出生9-14天用剪趾法标记，收集剪下的组织，用碱裂解法提取基因组DNA，利用特异引物通过PCR法进行检测；（8）运用RT-PCR及Westernblot技术筛选出Navβ2-ICD表达水平最低的品系，建立稳定的Navβ2V173A，V175K点突变制得Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 昆明医科大学 一种Navβ2-ICD低表达转基因鼠模型的构建方法及其应用

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