申请/专利权人：云南中医药大学

申请日：2022-04-08

公开（公告）日：2024-02-13

公开（公告）号：CN114657208B

主分类号：C12N15/82

分类号：C12N15/82;C12N15/29;C12Q1/6895;C12Q1/686;A01H5/06;A01H6/00;A01H4/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.13#授权;2022.07.26#实质审查的生效;2022.06.24#公开

摘要：本发明公开了一种蜘蛛香转基因毛状根遗传转化体系的建立方法，包括含外植体的选择、农杆菌的活化、目标基因的植物表达载体构建、重组载体的发根农杆菌工程菌液的培养、外植体的浸染、共培养、发根诱导和培养、RT‑PCR检测。本发明利用含有VjBIS1基因的K599‑pBI121‑VjBIS1工程菌菌液浸染蜘蛛香叶片外植体，获得的转基因毛状根，培养过程简单，实验结果直观，可稳定持续获得蜘蛛香转基因毛状根。本发明为利用转基因毛状根生产蜘蛛香药用活性成分提供基础和技术支撑。

主权项：1.一种蜘蛛香转基因毛状根遗传转化体系的建立方法，其特征在于,包括如下步骤：（1）蜘蛛香外植体的准备选择蜘蛛香嫩叶为外植体材料，置于超净工作台中消毒，外植体接种到MS培养基上培养，培养条件为：温度为25℃，光照强度为2000Lx，光照周期为16h8h；（2）发根农杆菌的活化和培养发根农杆菌为K599，将发根农杆菌在含有链霉素的TY固体培养基上划线，挑取单菌落，置于5mL含有相应抗菌素TY液体培养基中，28℃、200rmin振荡培养12h；吸取上述菌液5mL接种于50mLTY液体培养基中进行扩增培养，28℃、240rmin振荡培养至菌液OD600为0.6-0.8，TY培养基中活化和扩大培养时，需要培养基中添加50mgL链霉素Strep；（3）含目标基因重组载体工程菌液的构建及培养将蜘蛛香VjBIS1基因与植物表达载体pBI121连接，获得含目标基因的植物表达载体，再将其转入发根农杆菌，获得含有VjBIS1基因的植物表达载体的发根农杆菌工程菌；VjBIS1基因的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示；（4）浸染外植体挑取工程菌单菌落，摇菌扩大培养，将无菌蜘蛛香外植体放于工程菌菌液中浸染10min；（5）外植体除菌和转基因毛状根诱导将侵染后的外植体接种于MS培养基中共培养2d，再接种于除菌培养基中，约10-15d毛状根长出，所述除菌培养基为：MS＋30gL蔗糖＋8gL琼脂＋200mgL头孢噻吩钠；（6）毛状根继代增殖培养毛状根长1-3cm时从外植体上切下，置于MS液体培养基中进行扩大培养，扩大培养基中培养条件为：MS＋30gL蔗糖，pH为5.8，培养条件28℃，暗培养；（7）RT-PCR检测提取获得转基因毛状根的总RNA，反转录成cDNA，进行RT-PCR检测。

全文数据：

权利要求：

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