申请/专利权人：苏中药业集团股份有限公司

申请日：2016-12-19

公开（公告）日：2024-02-23

公开（公告）号：CN108205022B

主分类号：G01N30/02

分类号：G01N30/02

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.02.23#授权;2022.06.21#著录事项变更;2018.07.20#实质审查的生效;2018.06.26#公开

摘要：本发明提供了颐和春制剂中人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量测定方法，以人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品为对照，以乙腈为流动相A、水为流动相B，采用梯度和等度洗脱相结合的高效液相色谱法测定颐和春制剂中人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量。该方法分离效果好，检测灵敏度高，稳定性好，可以精确测定颐和春制剂中人参皂苷Rg1，Re，Rb1的含量，能够全面、客观地体现和评价颐和春制剂质量，具有精密度高、稳定性好、重现性好、线性好、回收率高等特点，可有效提高颐和春制剂的质量控制标准，确保其临床疗效。

主权项：1.颐和春制剂中人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量测定方法，其特征在于：以人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品为对照，以乙腈为流动相A、水为流动相B，采用高效液相色谱法测定颐和春制剂中人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量；色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为WatersSymmetryC18250mm×4.6mm，5um，检测波长为203nm，柱温30℃；流速1.0mlmin，洗脱程序为： 时间min 流动相A 流动相B 0-35 20% 80% 35-55 20%—29% 80%—71% 55-70 29% 71% 其中，供试品溶液由如下方法制备：取颐和春制剂，精密称定并置于锥形瓶中，加入甲醇溶剂超声、离心，取上清液，残渣加入甲醇溶剂超声、离心，合并上清液；将上清液减压浓缩；残渣加水溶解，乙醚萃取；弃去乙醚层，水层中加入水饱和的正丁醇萃取4次；正丁醇层依次用0.2%-0.6%氢氧化钠水溶液洗涤2次和正丁醇饱和的水洗涤1次，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇溶解并定容，摇匀，即得。

全文数据：颐和春制剂中人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量测定方法技术领域[0001]本发明属于中药检测技术领域，涉及一种使用高效液相色谱法测定颐和春制剂中人参皂苷RgI、Re、Rb1含量测定方法。背景技术[0002]颐和春制剂，由人参、川牛膝、狗肾、熟地黄、鹿茸、淫羊藿、韭菜子、蛇床子、锁阳等15味药材组成，主要用于补肾壮阳，用于肾阳虚引起的阳痿、遗精、腰膝酸软，其疗效显著、副作用小、使用方便。其中，人参为君药，其有效成分为人参皂苷Rgi，Re，Rbi，为了保证颐和春制剂的药品质量，需对制剂中人参皂苷Rgi，Re，Rb1含量进行测定，以确保有效成分含量稳定均一。[0003]高效液相色谱HPLC具有灵敏度高、准确度高等优点，已成为控制中药质量的重要手段之一，其基本模式为等度和梯度洗脱，将这两种模式组合应用，可将成分较好分离开。现有技术中常采用高效液相色谱法测定含人参中药制剂中人参皂苷Rg1,Re，Rbj^含量，例如专利CN102435697A、CN104807905A等公开了采用HPLC等度和梯度结合方式进行检测中药制剂中人参皂苷Rgi，Re，Rb1的含量检测。但由于颐和春制剂由15种中药组成，其组分比较复杂样品预处理极其重要），多于其他中药制剂组分；同时等度和梯度洗脱的组合方式难以计数，且梯度洗脱的分离机理比较复杂，现有文献披露的实验方案无法满足颐和春制剂中人参皂苷Rg1，Re，Rb1的分离和含量检测。[0004]本发明主要对颐和春制剂的预处理及HPLC分析条件进行研究，开发出一种可将颐和春制剂中人参皂苷Rgl、Re、Rb1完全分离的分析方法。发明内容[0005]发明目的:本发明的目的是提供一种颐和春制剂中相关物质的含量检测方法，[0006]技术方案:本发明提供了颐和春制剂中人参皂苷Rgl、Re、Rb1含量测定方法，以人参皂苷Rgl、Re、Rbl对照品为对照，以乙腈为流动相A、水为流动相B，采用梯度和等度洗脱相结合的高效液相色谱法测定颐和春制剂中人参皂苷Rgl、Re、Rbl含量。[0007]优选地，所述颐和春制剂中人参皂苷Rgl、Re、Rb1含量测定方法包括以下步骤：[0008]1对照品制备:精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rb1对照品，加甲醇溶解制成每Iml含Rgl、Re、Rbl分别为0·05mg、0·25mg、0·60mg的混合溶液，摇匀，即得；[0009]2供试品溶液制备:取颐和春制剂，精密称定并置于锥形瓶中，加入醇类溶剂超声、离心，取上清液，残渣加入醇类溶剂超声、离心，合并上清液;将上清液减压浓缩;残渣加水溶解，乙醚萃取;弃去乙醚层，水层中加入水饱和的正丁醇萃取;正丁醇层依次用氢氧化钠水溶液和正丁醇饱和的水洗涤，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇溶解并定容，摇匀，即得；[0010]3人参皂苷Rgl、Re、Rb1含量测定:分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液1Ομί，注入高效液相色谱仪，测定;色谱条件为：[0011]填充剂:十八烷基硅烷健合硅胶；[0012]色谱柱：WatersSymmetryC18250mmX4.6mm，5um;[0013]乙腈为流动相A，水为流动相B;[0014]检测波长为203nm，柱温30°C，流速I.Omlmin;[0015]理论塔板数在6000以上，以人参皂苷Rgl计；[0016]洗脱程序：[0018]其中，步骤⑵中，所述醇类溶剂为甲醇。[0019]其中，步骤⑵中，离心速度4000-6000rmin、离心时间5-15分钟。[0020]其中，步骤⑵中，氢氧化钠水溶液的浓度为0.2%-0.6%。[0021]其中，步骤⑵中，超声时间为〇.5-2h;减压浓缩温度为40°C_60°C;蒸干温度为95-105。。。[0022]其中，所述颐和春制剂包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、口服液。[0023]有益效果:本发明方法分离效果好，检测灵敏度高，稳定性好，可以精确测定颐和春制剂中人参皂苷Rgi，Re，Rb1的含量，能够全面、客观地体现和评价颐和春制剂质量，具有精密度高、稳定性好、重现性好、线性好、回收率高等特点，可有效提高颐和春制剂的质量控制标准，确保其临床疗效。附图说明[0024]图1为人参皂苷Rgl标准曲线；[0025]图2为人参皂苷Re标准曲线；[0026]图3为人参皂苷Rbl标准曲线。具体实施方式[0027]对照品及供试品来源：[0028]人参皂苷1^对照品：中国食品药品检验所批号：110703-201529[0029]人参皂苷Re对照品：中国食品药品检验所批号：110754-201525[0030]人参皂苷版对照品：中国食品药品检验所批号：110704-201424[0031]颐和春制剂:江苏苏中药业集团股份有限公司，市售[0032]人参阴性对照样品的制备方法:按供试品溶液制备方法操作，制备人参阴性对照液原料为不包括人参的颐和春制剂，该制剂的制备方法与颐和春制剂类似）。[0033]实施例1[0034]⑴对照品溶液制备[0035]精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rb1对照品，加甲醇溶解制成每Iml含1^1、1^、1?131分别为0.0511^、0.2511^、0.6〇11^的混合溶液，摇勾，即得。[0036]2供试品溶液制备[0037]精密称取粉碎过四号筛后颐和春制剂IOg于锥形瓶中，加入甲醇150ml超声1小时，取出，以4000rmin的转速离心8分钟，取上清液，残渣加甲醇150ml超声40min，以4000rmin的转速离心8分钟，合并两次上清液。将溶液置50°C水浴减压浓缩至干。加水40ml溶解残渣并完全转移至分液漏斗中，用乙醚50ml萃取一次，弃去乙醚液，加水饱和的正丁醇提取4次，每次40ml，合并正丁醇提取液。加0.2%氢氧化钠溶液洗涤2次，每次40ml，弃去碱液，加正丁醇饱和的水50ml洗涤1次，弃去水层，将正丁醇液置100°C水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至IOml，摇勾即得。[0038]3人参皂苷Rgl、Re、Rbl含量测定:分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液10μ1，注入高效液相色谱仪，测定；[0039]仪器:Agilent1260,高效液相色谱仪系统包括四元栗、柱温箱、紫外检测器、化学色谱数据工作站等；[0040]色谱条件为：[0041]填充剂:十八烷基硅烷健合硅胶；[0042]色谱柱：WatersSymmetryC18250mmX4.6mm，5um;[0043]乙腈为流动相A，水为流动相B;[0044]检测波长为203nm，柱温30°C，流速I.Omlmin;[0045]理论塔板数在6000以上，以人参皂苷Rgl计；[0046]洗脱程序：[0048]实施例2[0049]1专属性试验：[0050]取人参阴性对照品，按实施例1中供试品溶液的制备方法制备人参阴性对照液。[0051]依含量测定方法，分别进样人参皂苷RgI、Re、Rb1对照品溶液、供试品溶液和人参阴性对照液。[0052]结果显示：人参皂苷Rgl、Re、Rbl与其他峰分离较好，人参阴性对照液在相应位置无干扰。结果见表1。[0053]表1专属性试验结果[0056]注:组I人参阴性对照组在相应位置处无峰。[0057]2线性关系考察：[0058]精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rb1对照品，加甲醇溶解制成每Iml含Rgl、Re、Rbl分别为0·05mg、0·25mg、0·60mg的混合对照品溶液；分别精密量取7.5、10、12.5、15、17.5、2^1注入液相色谱仪，色谱条件同实施例1，记录色谱图。[0059]以进样量X:yg为横坐标，以峰面积⑺为纵坐标，进行线性回归。[0060]人参皂苷!^:回归方程:Y=18·71X+9·832r=0·998;结果表明：在0·459〜1·224yg的进样量范围内，本品峰面积与进样量的线性关系良好。[0061]人参皂苷Re回归方程:Y=57.20X+39.30r=0.999;结果表明：在1.540〜4.108μg的进样量范围内，本品峰面积与进样量的线性关系良好。[0062]人参皂苷Rbi回归方程：Y=131.3X-18.24r=0.999;结果表明：在4.126〜11.004yg的进样量范围内，本品峰面积与进样量的线性关系良好。[0063]结果见表2以及图1、图2、图3。[0064]表2人参皂苷Rgl、Re、Rbl线性关系实验结果[0065][0066]3精密度试验[0067]取配置好的供试品溶液，连续进样6次，色谱条件同实施例1;记录色谱图，计算RSD值，结果表明本法进样精密度良好，符合测试要求，见表3-5。[0068]表3人参皂苷Rg1进样精密度试验结果[0069][0070]表4人参皂苷Re进样精密度试验结果[0071][0072]表5人参皂苷Rb1进样精密度试验结果[0073][0074]⑷稳定性试验：[0075]取配置好的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12小时，精密量取10μ1，依法进样，色谱条件同实施例1，记录色谱图，以0小时相对含量为100%计算RSD值。结果表明，本品供试品溶液在12小时内基本稳定，见表6-8。[0076]表6供试品溶液人参皂苷RgJI定性试验结果[0077][0078]表7供试品溶液人参皂苷Re稳定性试验结果[0079][0080]表8供试品溶液人参皂苷RbJI定性试验结果[0081][0082][0083]重复性：[0084]取配置好的供试品溶液，照实施例1方法进行测定共6份），计算RSD%值。结果表明，本法重复性试验良好，符合测试要求，见表9-11。[0085]表9人参皂苷尺抑重复性试验结果[0086][0087]表10人参皂苷Re重复性试验结果[0088][0089]表11人参皂苷Rbl重复性试验结果[0090][0091]⑸加样回收：[0092]精密称取颐和春制剂10g，置锥形瓶中，共9份，第1、2、3份分别加入0.376mg人参皂苷Rgl、1.814mg人参皂苷Re、5.184mg人参皂苷Rb^合对照品；第4、5、6份分别加入0.473mg人参皂苷1^1、2.27711^人参皂苷1^、6.42911^人参皂苷1^1混合对照品；第6、7、8份分别加入0.567mg人参皂苷Rg1、2.733mg人参皂苷Re、7.714mg人参皂苷Rb1混合对照品，摇匀，按照实施例1供试品溶液的制备方法操作，并按照含量测定项下色谱条件测定人参皂苷Rgl、Re、Rb1的含量，根据加入量及测得量计算回收率，结果表明，本法回收率在90%〜110%之间，可见本法准确度良好，符合测试要求，见表12。[0093]表12加样回收率试验结果[0094][0096]实施例3[0097]1对照品溶液制备[0098]精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rb1对照品，加甲醇溶解制成每Iml含1^1、1^、1?131分别为0.0511^、0.2511^、0.6〇11^的混合溶液，摇勾，即得。[0099]2供试品溶液制备[0100]精密称取粉碎过四号筛后颐和春制剂IOg于锥形瓶中，加入甲醇150ml超声1小时，取出，以5000rmin的转速离心15分钟，取上清液，残渣加甲醇150ml超声30min，以5000rmin的转速离心15分钟，合并两次上清液。将溶液置40°C水浴减压浓缩至干。加水40ml溶解残渣并完全转移至分液漏斗中，用乙醚50ml萃取一次，弃去乙醚液，加水饱和的正丁醇提取4次，每次40ml，合并正丁醇提取液。加0.4%氢氧化钠溶液洗涤2次，每次40ml，弃去碱液，加正丁醇饱和的水50ml洗涤1次，弃去水层，将正丁醇液置100°C水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10ml，摇勾即得。[0101]⑶人参皂苷Rgl、Re、Rb1含量测定:分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液1Ομί，注入高效液相色谱仪，测定；[0102]仪器:Agilent1260,高效液相色谱仪系统包括四元栗、柱温箱、紫外检测器、化学色谱数据工作站等；[0103]色谱条件为：[0104]填充剂:十八烷基硅烷健合硅胶；[0105]色谱柱：WatersSymmetryC18250mmX4.6mm，5um;[0106]乙腈为流动相A，水为流动相B;[0107]检测波长为203nm，柱温30°C，流速I.Omlmin;[0108]理论塔板数在6000以上，以人参皂苷Rgl计；[0109]洗脱程序：[0111]实施例4[0112]1对照品溶液制备[0113]精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rbet照品，加甲醇溶解制成每Iml含1^1、1^、1?131分别为0.0511^、0.2511^、0.6〇11^的混合溶液，摇勾，即得。[0114]2供试品溶液制备[0115]精密称取粉碎过四号筛后颐和春制剂IOg于锥形瓶中，加入甲醇150ml超声1小时，取出，以6000rmin的转速离心5分钟，取上清液，残渣加甲醇150ml超声120min，以6000rmin的转速离心5分钟，合并两次上清液。将溶液置60°C水浴减压浓缩至干。加水40ml溶解残渣并完全转移至分液漏斗中，用乙醚50ml萃取一次，弃去乙醚液，加水饱和的正丁醇提取4次，每次40ml，合并正丁醇提取液。加0.6%氢氧化钠溶液洗涤2次，每次40ml，弃去碱液，加正丁醇饱和的水50ml洗涤1次，弃去水层，将正丁醇液置100°C水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10ml，摇勾即得。[0116]3人参皂苷Rgl、Re、Rbl含量测定:分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液ΙΟμΙ，注入高效液相色谱仪，测定；[0117]仪器:Agilent1260,高效液相色谱仪系统包括四元栗、柱温箱、紫外检测器、化学色谱数据工作站等；[0118]色谱条件为：[0119]填充剂:十八烷基硅烷健合硅胶；[0120]色谱柱：WatersSymmetryC18250mmX4.6mm，5um;[0121]乙腈为流动相A，水为流动相B;[0122]检测波长为203nm，柱温30°C，流速I.Omlmin;[0123]理论塔板数在6000以上，以人参皂苷Rgl计；[0124]洗脱程序：

权利要求：1.颐和春制剂中人参皂苷Rgl、Re、Rbl含量测定方法，其特征在于：以人参皂苷Rgl、Re、Rbl对照品为对照，以乙腈为流动相A、水为流动相B，采用梯度和等度洗脱相结合的高效液相色谱法测定颐和春制剂中人参皂苷Rgl、Re、Rbl含量。2.根据权利要求1所述的颐和春制剂中人参皂苷Rgl、Re、Rbl含量测定方法，其特征在于:包括以下步骤：1对照品制备:精密称取人参皂苷Rgi对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷!^!对照品，加甲醇溶解制成每Iml含Rgl、Re、Rb1分别为O·05mg、O·25mg、O·60mg的混合溶液，摇匀，即得；2供试品溶液制备:取颐和春制剂，精密称定并置于锥形瓶中，加入醇类溶剂超声、离心，取上清液，残渣加入醇类溶剂超声、离心，合并上清液;将上清液减压浓缩;残渣加水溶解，乙醚萃取;弃去乙醚层，水层中加入水饱和的正丁醇萃取;正丁醇层依次用氢氧化钠水溶液和正丁醇饱和的水洗涤，正丁醇层蒸干，残渣加甲醇溶解并定容，摇匀，即得；3人参皂苷Rgl、Re、Rbl含量测定:分别精密吸取供试品溶液与对照品溶液ΙΟμΙ，注入高效液相色谱仪，测定;色谱条件为：填充剂:十八烷基硅烷健合硅胶；色谱柱：WatersSymmetryC18250mmX4.6mm，5um;乙腈为流动相A，水为流动相B;检测波长为203nm，柱温30°C，流速I.Omlmin;理论塔板数在6000以上，以人参皂苷Rgl计；洗脱程序：3.根据权利要求2所述的颐和春制剂中人参皂苷Rgl、Re、Rbl含量测定方法，其特征在于:步骤⑵中，所述醇类溶剂为甲醇。4.根据权利要求2所述的颐和春制剂中人参皂苷Rgl、Re、Rbl含量测定方法，其特征在于:步骤2中，离心速度4000-600^1^11、离心时间5-15分钟。5.根据权利要求2所述的颐和春制剂中人参皂苷Rgl、Re、Rbl含量测定方法，其特征在于:步骤2中，氢氧化钠水溶液的浓度为0.2%-0.6%。6.根据权利要求2所述的颐和春制剂中人参皂苷Rgl、Re、Rbl含量测定方法，其特征在于:步骤⑵中，超声时间为0.5-2h;减压浓缩温度为40°C-60°C;蒸干温度为95-105°C。7.根据权利要求2所述的颐和春制剂中人参皂苷Rgl、Re、Rbl含量测定方法，其特征在于:所述颐和春制剂包括颗粒剂、片剂、胶囊剂、□服液。

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