申请/专利权人：中国农业科学院兰州兽医研究所

申请日：2021-06-11

公开（公告）日：2024-03-05

公开（公告）号：CN113355275B

主分类号：C12N5/071

分类号：C12N5/071;C12N5/10;C12N7/00

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.05#授权;2021.09.24#实质审查的生效;2021.09.07#公开

摘要：本发明公开了一种羔绵羊睾丸支持细胞、睾丸支持细胞亚克隆及其分离方法和应用，其中，所述支持细胞SCST的保藏编号为CCTCCNo.C2019203，将其转染SV40大T抗原基因使其永生化，然后进行压力粗筛、压力分种以及持续传代，得到细胞亚克隆SCST‑TF13，其保藏编号为CCTCCNo.C202130，可用于牛结节性皮肤病、羊痘及羊口疮等病毒的分离及规模化繁殖。所述细胞亚克隆可以用含国产血清的培养基培养，降低了生产成本，适合规模化生产应用。本发明的细胞亚克隆与常规原代细胞相比，而且能够明显提高牛结节性皮肤病毒的分离率，且牛结节性皮肤病毒的致病变时间明显缩短、分离病毒的拷贝数比传统细胞提高100倍以上，可以为牛结节性皮肤病毒的规模化繁殖及病毒感染致病机制研究提供工具。

主权项：1.一种羔绵羊睾丸支持细胞SCST的应用，其特征在于，所述羔绵羊睾丸支持细胞SCST保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.C2019203，分离方法包括以下步骤：步骤1、无菌取出羔羊睾丸，去除外膜，用pH7.0、浓度为0.05molL的PBS缓冲液冲洗后，无菌剪碎，先用0.25%胰酶消化20-50min，然后用Ⅳ型胶原酶消化0.5-1h，加入1%血清，终止消化，离心，沉淀用含0.05%胰蛋白酶和0.02%EDTA的消化液重悬，37℃保温10-30min后过滤，滤液离心，得到的沉淀用含1%小牛血清的营养液重悬，再离心，再用含10%进口胎牛血清的营养液重悬，部分以1.0x106个ml铺于附着延伸因子（AttachmentFactor）提前处理2h的细胞瓶，剩余细胞按照小牛血清与DMSO体积比9:1重悬，置于冻存盒放-80℃冰箱，次日投液氮保存备用；步骤2、将铺于细胞瓶的细胞次日洗出上层细胞液入另一细胞瓶，加新鲜培养基，第5d时，用0.01-0.05%胰酶消化处理细胞2-3min，弃掉细胞液，更换新鲜培养基，反复3-6次后，得到活力旺盛的羔绵羊睾丸支持细胞SCST；上述羔绵羊睾丸支持细胞SCST的应用方法为：将所述羔绵羊睾丸支持细胞SCST直接用于牛结节性皮肤病毒的分离培养；或将羔绵羊睾丸支持细胞SCST转染SV40大T抗原基因使其永生化，然后进行压力粗筛、压力分种以及持续传代13代，得到羔绵羊睾丸支持细胞亚克隆，即羔绵羊睾丸细胞SCST-TF13，用于牛结节性皮肤病毒的分离及规模化繁殖；该羔绵羊睾丸细胞SCST-TF13保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo.C202130。

全文数据：

权利要求：

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