申请/专利权人：江苏艾菱菲生物科技有限公司

申请日：2023-12-04

公开（公告）日：2024-03-08

公开（公告）号：CN117660540A

主分类号：C12N15/87

分类号：C12N15/87;C12N15/113;C12N9/22

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.03.26#实质审查的生效;2024.03.08#公开

摘要：本发明公开了一种猪胎儿成纤维细胞Apoe基因的敲除方法，属于基因敲除技术领域，本发明中，进行电转及RNP复合物的组装，培养猪成纤维细胞38.5℃、5％CO2、90％DMEMF12、10％FBS、5ngmLFGF，当汇合度90％时，使用PBS清洗细胞，然后用0.25％酶消化分离、收集培养的目标细胞，细胞数量1x105；以CRISPR‑Cas9技术，敲除猪成纤维细胞APOE基因编码区原理为让编码区移码突变，得到APOE基因敲除纯合细胞系，以此细胞系进行体细胞克隆，得到APOE基因敲除猪，为后续研究动脉粥样硬化发生、发展以及其对冠心病调控研究奠定基础。

主权项：1.一种猪胎儿成纤维细胞Apoe基因的敲除方法，其特征在于：所述猪胎儿成纤维细胞Apoe基因的敲除方法包括以下步骤：S1:先进行sgRNA引物的设计，选择外显子为第2、4个，选择两对sgRNA，并把设计好的sgRNA进行合成构建；S2:合成构建好sgRNA之后开始进行电转及RNP复合物的组装，培养猪成纤维细胞38.5℃、5％CO2、90％DMEMF12、10％FBS、5ngmLFGF，当汇合度90％时，使用PBS清洗细胞，然后用0.25％酶消化分离、收集培养的目标细胞，细胞数量1x105；S3:将步骤S2中已经准备好的细胞放入离心机的内部，控制离心机速度为1000rpm，控制离心时间为5min进行离心；S4:等到步骤S3中离心结束之后，用1mLPBS重悬细胞，准备好的细胞均在冰上放置备用；S5:在步骤S4中的冰上冰解GFP-cas9蛋白、sgRNA；S6:等到步骤S5中冰解GFP-cas9蛋白、sgRNA之后，准备首先制备RNP复合物；S7:采用lonza电转系统，并同时使用P3PrimaryCell4D-XKit进行试剂配置；S8:等到RNP孵育结束，将混有RNP的电转液重悬上述备用细胞，置于电转仪中电转，等到电转仪中电转结束后将细胞置于24孔板中，37℃细胞培养箱中继续培养；S9:在细胞培养箱中继续培养结束之后，进行转染效率鉴定及基因编辑效率预鉴定，转染36h后进行绿色荧光拍照，检测转染效率；转染72h后，提取细胞DNA，以敲除外显子两端区域设计特异性引物进行PCR检测，产物使用1％琼脂糖凝胶电泳观察，并进行测序；S10:测序完成结束之后进行单克隆细胞筛选，转染96h后，使用胰酶进行消化，采用无限稀释法，将单个克隆移至96孔板中继续培养；S11:在96孔板中培养完成之后，进行单克隆细胞筛选完成PCR鉴定、测序以及扩大培养，待单克隆长满96孔板后，挑取一半细胞提取DNA，进行PCR鉴定及测序，选择测序结果为双链DNA均敲除的细胞株继续6孔板培养，待长满后，提取蛋白进行WB鉴定，验证基因是否表达。

全文数据：

权利要求：

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