申请/专利权人：重庆市农业科学院

申请日：2023-11-15

公开（公告）日：2024-03-19

公开（公告）号：CN117721247A

主分类号：C12Q1/70

分类号：C12Q1/70;C12Q1/6869;C12Q1/686;C12R1/94

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.05#实质审查的生效;2024.03.19#公开

摘要：本发明公开了花椒黄花病病原鉴定方法，包括以下步骤：步骤1：引物设计：步骤2：RNA的提取和cDNA的合成；步骤3：PCR检测体系：以cDNA为模板，使用病毒的特异性引物对青花椒样品进行PCR扩增；步骤4：高通量测序：从采集的青花椒样品中选择DX‑148作为带毒样品和三株健康植株作为对照植株；样品使用标准提取方法提取RNA，按照NEB普通建库方式或链特异性建库方式对质控合格的RNA进行建库，库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina测序。本发明通过引物设计、RNA的提取和cDNA的合成等鉴定步骤的设计，可以准确全面的对花椒黄花病病原进行鉴定，从而有效提升了花椒黄花病的早期诊断和后续防治效果。

主权项：1.花椒黄花病病原鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：引物设计：使用DNAMAN7设计GSPNeVRNA1、GSPIV、GSPEVGenBankno.MH323436.1、GSPNuV、GSPVCaV和satGSPNeV这五种病毒和卫星病毒的特异性引物，内参引物根据GenBank中报道的花椒的部分ITS2序列GenBankno.KX192307.1设计；步骤2：RNA的提取和cDNA的合成：采用CTAB法提取植物RNA，将0.1g叶组织在液氮中充分研磨，并用1mL2％的CTAB缓冲液2％CTAB、4％PVP-40、100mM的Tris-HClpH8.0、25mM的EDTApH8.0、2M的NaCl和1％的β-巯基乙醇提取，涡旋，并在65℃下孵育20分钟；在12000g离心15分钟后，将上清液转移到新鲜离心管中，加入等体积的氯仿，涡旋，并在室温下孵育3分钟；在12000g离心15分钟后，转移上清液并与上清液体积的13的LiCl8M混合以沉淀RNA；将混合物在-80℃下保持30分钟或-20℃过夜，并以12000g离心20分钟，将沉淀颗粒用75％乙醇洗涤两次，并溶解在不含RNase的水中；步骤3：PCR检测体系：以cDNA为模板，使用病毒的特异性引物对青花椒样品进行PCR扩增；PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存；待PCR扩增结束后，使用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，上样5μl，最后使用凝胶成像仪观测并记录结果；步骤4：高通量测序：从采集的青花椒样品中选择DX-148作为带毒样品和三株健康植株作为对照植株；样品使用标准提取方法提取RNA，按照NEB普通建库方式或链特异性建库方式对质控合格的RNA进行建库，库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina测序。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 重庆市农业科学院 花椒黄花病病原鉴定方法

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