申请/专利权人：南京科瑞斯生物科技有限公司

申请日：2023-08-09

公开（公告）日：2024-03-19

公开（公告）号：CN116694689B

主分类号：C12N15/867

分类号：C12N15/867;C12N5/10;C12N5/071

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.19#授权;2023.09.22#实质审查的生效;2023.09.05#公开

摘要：本发明涉及生物技术领域，公开了一种慢病毒包装方法，包括：将293T细胞接种到T25T75培养瓶中培养，待细胞长到80%时转染；在载体总量不变的情况下，根据穿梭载体的大小，调整穿梭载体与辅助载体的质量比例，将质粒和转染试剂混合孵育，再将其添加到培养瓶中转染；转染18~24h后，弃去培养液，加入新鲜培养基；在换液24h时，收取细胞培养上清液，并添加新鲜培养基，48h时再吸取细胞培养上清液，与24h收取的上清液合并；收集到的上清液进行初步纯化；再进行慢病毒的浓缩与纯化。本发明提供的慢病毒包装方法中，利用自定义公式计算穿梭载体与辅助载体的比例，高效便捷地包装出不同种类的高质量慢病毒。

主权项：1.一种慢病毒包装方法，其特征在于，包括：将293T细胞接种到T25T75培养瓶中的含10%FBS的DMEM培养基中培养，培养过夜待细胞覆盖度生长到80%时准备转染；在载体总量不变的情况下，根据穿梭载体的大小，调整穿梭载体与辅助载体的质量比例，质粒和转染试剂中分别加入DMEM培养基，将二者混合后孵育15min，再将该混合物添加到已更换新鲜的含10%FBS的DMEM培养基的细胞培养瓶中，进行质粒转染；转染18~24h后，弃去培养瓶中的培养液，加入含10%FBS的DMEM培养基；在换液24h时，吸取细胞培养上清液于离心管，同时添加新的含10%FBS的DMEM培养基到培养瓶中，48h时再吸取细胞培养上清液，并和24h收取的上清液合并；收集到的上清液进行初步纯化；采用PEG慢病毒纯化试剂，进行慢病毒的浓缩与纯化；采用慢病毒保存液溶解慢病毒沉淀，并进行分装与保存；所述穿梭载体与辅助载体的质量计算公式如下：穿梭载体的质量=19L2218+4*L2218*M，第一辅助质粒的质量=19L2218+4*3*M，第二辅助质粒的质量=19L2218+4*1*M，其中，参数L为穿梭载体的全长，参数M为放大倍数；当L≥12000bp时，M为1.3；当11000bp≤L＜12000bp时，M为1.2；当10000bp≤L＜11000bp时，M为1.1；当L＜10000bp时，M为1；第一辅助质粒为包装质粒，第二辅助质粒为包膜质粒；所述293T细胞的接种数量为：使用T25培养瓶时所对应的接种数量为0.8×106，使用T75培养瓶时所对应的接种数量为2.5×106；所述转染试剂为EZTrans细胞转染试剂；所述质粒转染的具体方法为：取2支离心管分别加入DMEM培养基；先向1支离心管中加入计算好的质粒，吹打混匀，在管上标记为质粒稀释管；再向另1只离心管加入转染试剂，吹打混匀，然后加入到对应的质粒稀释管中，并吹打均匀；室温孵育15min；弃去培养瓶的培养液，加入含10%FBS的DMEM培养基；立起培养瓶，将孵育好的混合体系加入到培养瓶底部的培养基中，混匀后放入培养箱培养；所述初步纯化的方法为：将收集到的上清液先4℃、500g离心10min，取上清后再用0.45μm无菌滤器过滤后，得到初步纯化后的病毒上清；所述慢病毒的浓缩与纯化的方法为：在初步纯化后的病毒上清中加入PEG慢病毒纯化试剂，4℃沉淀1.5h，每30min上下颠倒混匀一次；4℃、7000g离心10min后吸弃上清，冰盒内正放离心管，静置1min，吸走底部残余液体。

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