申请/专利权人：德州蓝力生物技术有限公司

申请日：2024-01-08

公开（公告）日：2024-03-22

公开（公告）号：CN117512043B

主分类号：C12P21/06

分类号：C12P21/06;C07K1/34;C07K7/06;C07K7/08

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.22#授权;2024.02.27#实质审查的生效;2024.02.06#公开

摘要：本发明属于肽提取技术领域，具体涉及一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，MRM分子共振木瓜蛋白酶酶解，超滤膜分级，以及后续胃蛋白酶、酰基转移酶I的分级酶解。本发明设计负离子的发生量为2000个e‑cm3～2500个e‑cm3的MRM分子共振技术贯穿蛋白源制备过程以及木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的酶解过程，促进提高蛋白质提取率，以及促进酶解提升菊芋肽提取率，还配合超滤膜分级，进行分离酶解，改变小于3kDa的产物的酶解顺序，获得了较高的菊芋肽提取率。

主权项：1.一种降血糖抗氧化菊芋肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：将菊芋新鲜叶片进行水洗、烘干，然后粉碎成粉体，按粉体：NaCl溶液=1：（15～20）的质量比，将粉体加入NaCl溶液中，然后将MRM分子共振板静置于NaCl溶液中进行反应，形成负离子发生量为2000个e-cm3～2500个e-cm3，保持浸泡3h～4h；之后离心分离，收集上清液；向上清液中添加硫酸铵溶液，持续搅动，直到蛋白质完全析出；之后离心分离，收集沉淀，向沉淀中加入分子共振水，搅拌均匀，最后离心分离，得到蛋白质；所述分子共振水的制备方法为：将MRM分子共振板静置于水中进行反应，形成负离子发生量为2000个e-cm3～2500个e-cm3的分子共振水；S2：将蛋白质悬浮于pH7.0、50mM磷酸盐缓冲液中，终浓度为2%wv～3%wv，加入质量体积比为4%～6%的木瓜蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-cm3～2500个e-cm3的MRM分子共振环境下进行水浴65℃反应1h～1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，使用配备有截留分子量为5kDa和3kDa超滤膜的AmiconUltra-15离心超滤管，进行离心分离上清液，收集得到位于3kDa～5kDa之间和5kDa以上的超滤液A，小于3kDa的超滤液B，将超滤液A和超滤液B分别进行真空冷冻干燥，得到冻干品A和冻干品B；S3：将冻干品A悬浮于pH1.5、50mMKCl-HCl缓冲液中，终浓度为2%wv～3%wv，加入质量体积比为3%～5%的胃蛋白酶；在负离子的发生量为2000个e-cm3～2500个e-cm3的MRM分子共振环境下进行水浴37℃反应1h～1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品C；S4：将冻干品C悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2%wv～3%wv，加入质量体积比为6%～8%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h～1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品D；S5：将冻干品B悬浮于pH8.0、50mMTris-HCl缓冲液中，终浓度为2%wv～3%wv，加入质量体积比为6%～8%的酰基转移酶I；水浴57℃，25kHZ超声反应1h～1.5h，酶解完成后，沸水浴10min；冷却、离心，收集上清液，进行真空冷冻干燥，得到冻干品E；S6：将冻干品D和冻干品E进行混合，得到复合菊芋肽；所述复合菊芋肽中包含5种菊芋肽，分别为Pep1、Pep2、Pep3、Pep4和Pep5；所述Pep1的氨基酸序列SEQIDNO:1为ILLLRMGQRNLVVVS；所述Pep2的氨基酸序列SEQIDNO:2为VVQQYRYGWEAEAAAVV；所述Pep3的氨基酸序列SEQIDNO:3为VKKNPAAATEGIVI；所述Pep4的氨基酸序列SEQIDNO:4为GKGGQLARAAGAV；所述Pep5的氨基酸序列SEQIDNO:5为VVVVGLYYGFL；所述Pep1的提取率为3.6%以上，Pep2的提取率为4.8%以上，Pep3的提取率为3.4%以上，Pep4的提取率为4.6%以上，Pep5的提取率为3.2%以上。

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