申请/专利权人：扬州大学

申请日：2022-06-29

公开（公告）日：2024-03-26

公开（公告）号：CN114990078B

主分类号：C12N7/01

分类号：C12N7/01;C12N15/63;C12N15/62

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.03.26#授权;2022.09.20#实质审查的生效;2022.09.02#公开

摘要：本发明公开了带有His标签的重组新城疫病毒的构建方法及用途。基于已建立的基因VIId亚型新城疫病毒I4强毒株反向遗传操作系统，将His标签6×His与I4基因组全长转录载体pNDVI4中的HN基因融合，成功构建带有His标签的重组新城疫病毒基因组全长cDNA感染性克隆pNDVI4‑HN‑His。经转染得到重组新城疫病毒rNDVI4‑HN‑His，可通过标签蛋白抗体用于重组病毒HN蛋白的纯化及其与宿主蛋白互作研究。

主权项：1.带有His标签的重组新城疫病毒的构建方法，其特征在于：以新城疫病毒基因组全长克隆为骨架，将His标签置于HN基因之后，获得带有His标签的重组新城疫病毒基因组全长cDNA感染性克隆，将该感染性克隆与辅助质粒共转染细胞后获得相应表型的重组新城疫病毒，具体包括以下具体步骤：1）全长克隆pNDVI4-HN-His的构建以基因Ⅶd亚型新城疫病毒I4强毒株基因组全长转录载体pNDVI4为研究对象，以pNDVI4为模板，用NEW-FHISH-R和HISH-FHNF-R两对引物分别扩增I4基因组的6418-8130nt区域及8131-9530nt区域，扩增出的两个片段经同源重组克隆入pCR2.1载体后得到HN和His相融合的中间质粒pCR2.1-HN-His；使用限制性内切酶SacⅡ和FspAⅠ对该中间质粒进行酶切反应，回收目的片段与经同样酶切后的pNDVI4目的片段相连，构建得到全长克隆pNDVI4-HN-His；2重组病毒株rNDVI4-HN-His的拯救将全长质粒pNDVI4-HN-His与辅助质粒共转染BSR-T75细胞，后将上清与底壁细胞混匀后接种9-10日龄SPF鸡胚，置于鸡胚孵化箱培养，按OIE标准测定接种死亡鸡胚的尿囊液的HA效价，并收集阳性尿囊液，获得重组新城疫病毒rNDVI4-HN-His；其中，用于扩增目的基因的引物如下： 。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 扬州大学 带有His标签的重组新城疫病毒的构建方法及用途

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