申请/专利权人：新泰市佳禾生物科技有限公司

申请日：2021-11-30

公开（公告）日：2024-04-02

公开（公告）号：CN114196712B

主分类号：C12P13/10

分类号：C12P13/10;C12N9/78;C12N15/75;C12N15/55;C12N15/66;C12N11/14;C12N1/21;C12N1/38;C12R1/125

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.02#授权;2022.04.05#实质审查的生效;2022.03.18#公开

摘要：本发明公开了一种固定化酶法生产L‑鸟氨酸的方法，包括以下步骤：1将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，降温向体系中加入IPTG，诱导培养20‑28h；2将诱导培养后的培养液进行破菌处理并过陶瓷膜，收集滤液；滤液进行挂柱；3将含有L‑精氨酸的底物溶液流经挂柱后的镍柱进行生物转化，收集流出的转化液，即生产得到L‑鸟氨酸。本发明首先构建了一种新的人重组精氨酸酶I生产菌，并对发酵工艺进行了优化，提高了人重组精氨酸酶I的产量和酶活；然后将发酵生产的人重组精氨酸酶I采用镍柱挂柱对酶进行固定化处理；再流加底物液进行转化处理，从而实现了固定化酶法生产L‑鸟氨酸，提高了转化率。

主权项：1.一种固定化酶法生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32-34℃，pH为6.8-7.2，溶氧为20-40%，搅拌转速180-220rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD600值为0.50-0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmolL，诱导培养20-28h；培养过程中监测体系的甘油含量，当体系的甘油含量≤1.0gL时开始添加补料，通过流加补料使体系中的甘油含量保持在0.5-1gL；（2）将步骤（1）诱导培养后的培养液的pH值调至7.1-7.3，进行破菌处理；将细胞破碎后的混合匀浆过陶瓷膜，收集滤液；将滤液稀释至滤液中人重组精氨酸酶I的浓度为8-12gL，采用镍柱亲和层析，将稀释后的滤液进行挂柱；（3）将含有L-精氨酸的底物溶液流经步骤（2）挂柱后的镍柱进行生物转化，收集流出的转化液，即生产得到L-鸟氨酸；步骤（1）中，所述人重组精氨酸酶I生产菌由如下方法构建而成：将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将SEQIDNO.1所示的Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304-Pg3，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；再用SphⅠ和SacⅠ对质粒pHT304-Pg3进行双酶切处理，将arg1基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304-Pg3上，获得重组表达载体，其核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到人重组精氨酸酶I生产菌； arg1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.7中第5-1087位核苷酸所示；步骤（3）中，所述底物溶液中含有：L-精氨酸50gL，磷酸吡哆醛1mgL，二甲基亚砜0.1mgL。

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