申请/专利权人：深圳大学

申请日：2022-12-29

公开（公告）日：2024-04-02

公开（公告）号：CN116083541B

主分类号：C12Q1/6858

分类号：C12Q1/6858;C12Q1/6886;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.02#授权;2023.05.26#实质审查的生效;2023.05.09#公开

摘要：本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种富集低丰度单核苷酸变异体的方法，包括步骤：根据靶标序列设计Cas12a蛋白的crRNA；根据靶标序列设计用于扩增的正向引物和反向引物；将缓冲液与正向引物、反向引物和Cas12a蛋白、crRNA进行混合，得到反应体系；向反应体系中加入待测样品，然后在预定温度下反应预定时间，实现富集低丰度单核苷酸变异体。特别地，当在反应体系中加入荧光检测DNA单链探针reporter时，利用Cas12a的反式切割活性切割探针产生荧光信号，可以初步判定样本的SNV丰度。本发明利用反应体系包括RPA反应体系和CRISPRCas12a反应体系的特点，通过重组酶聚合酶扩增与CRISPR‑Cas12a在一管中对低丰度样品的竞争反应，实现富集SNV的目的，检测限可达0.01％。

主权项：1.一种非诊断目的的富集低丰度单核苷酸变异体并对样品SNV的丰度进行判定的方法，其特征在于，包括步骤：根据靶标序列设计Cas12a蛋白的crRNA；根据靶标序列设计用于扩增的正向引物和反向引物；反应体系包括RPA反应体系和CRISPR-Cas12a反应体系；所述RPA反应体系包括所述正向引物、所述反向引物、重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、缓冲液；所述CRISPR-Cas12a反应体系包括所述Cas12a蛋白、所述crRNA；所述反应体系中的引物加入的浓度为C引，所述Cas12a蛋白和所述crRNA各自的浓度在0-C引之间；向所述反应体系中加入待测样品，然后在预定温度下反应预定时间，实现富集低丰度单核苷酸变异体；向所述反应体系中加入荧光检测DNA单链探针和待测样品DNA，利用所述Cas12a蛋白的反式切割活性切割所述荧光检测DNA单链探针产生荧光信号，对所述待测样品的SNV丰度进行初步判定；所述crRNA是所述Cas12a蛋白的向导RNA，所述向导RNA包括通用序列和间隔序列；所述通用序列自主形成发卡结构；所述间隔序列与待测样品中的野生型DNA完全互补，所述间隔序列与待测样品中的单核苷酸变异体存在错配；所述通用序列为5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3’，所述间隔序列为连接在所述通用序列3’端的至少18个碱基X；其中，每个所述碱基X独立选自A、G、C或T中的一种；所述待测样品中含有野生型DNA和单核苷酸变异体；所述预定温度为37-42℃；所述预定时间为大于20分钟；所述荧光检测DNA单链探针两端分别修饰有荧光基团和猝灭基团；所述待测样品选自细菌、组织、体液中的一种。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 深圳大学 一种富集低丰度单核苷酸变异体的方法

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