申请/专利权人：中量大黄山高质量发展研究院有限公司

申请日：2022-03-07

公开（公告）日：2024-04-02

公开（公告）号：CN114438123B

主分类号：C12N15/84

分类号：C12N15/84;C12N15/66;C12N5/10;A01H5/00;A01H6/82

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.02#授权;2022.05.24#实质审查的生效;2022.05.06#公开

摘要：本发明公开了一种双子叶植物多基因编辑载体及其构建方法，涉及基因工程和生物技术技术领域。多基因编辑载体包括启动sgRNA的编码DNA转录的启动子、靶片段sgRNA转录的表达框、Cas9蛋白的表达框。本发明提供的多基因编辑载体利用OverlappingPCR结合酶切连接的方法将多个gRNA序列连接至已有Cas9序列的表达载体上，进而可以通过农杆菌侵染等转基因技术获得植物多突变体。利用这种OverlappingPCR结合酶切连接的构建策略，可以组合多个gRNA，通过一次转基因就可获得植物多突变体，从而建立了一种高效、便捷制备植物多突变体的方法。

主权项：1.一种番茄多基因编辑载体的构建方法，其特征在于，所述多基因编辑载体包括启动sgRNA的编码DNA转录的启动子、靶片段sgRNA转录的表达框、Cas9蛋白的表达框；番茄多基因编辑载体的构建方法包括：采用OverlappingPCR分别向启动子和非靶片段sgRNA中连入带有酶切位点的接头，经酶切后连接获得启动子-非靶片段sgRNA载体；然后分别将靶片段sgRNA与酶切后的启动子-非靶片段sgRNA载体连接，获得带有靶片段sgRNA转录的表达框的中间载体；分别将多个带有靶片段sgRNA转录的中间载体酶切后连接获得启动子调控的多元载体；然后利用限制性内切酶切割形成不同粘性末端将所述多元载体上的多个启动子调控的靶片段sgRNA连接至带有Cas9蛋白的表达框的载体中；其中，所述启动子-非靶片段sgRNA载体的构建包括：先对PMD18T改造以去除AtU6-26启动子和cas9序列获得PMD18T-DU6-26-DCAS9载体；然后通过如下方法获得三种启动子-非靶片段sgRNA载体：（1）利用OverlappingPCR分别向AtU6-26启动子中连入带有HindIII酶切位点的接头和向非靶片段sgRNA连入带有XbaI酶切位点的接头，分别对PMD18T-DU6-26-DCAS9载体和OverlappingPCR的扩增产物进行HindIII和XbaI酶切后连接，获得启动子-非靶片段sgRNA载体；（2）利用OverlappingPCR将AtU6-1启动子中连入带有XhoI酶切位点的接头，向非靶片段sgRNA连入带有BbsI和XbaI酶切位点的接头，经OverlappingPCR获得AtU6-1启动子和非靶片段sgRNA的融合产物；分别对PMD18T-DU6-26-DCAS9载体和融合产物进行XhoIXbaI双酶切后连接，获得启动子-非靶片段sgRNA载体；（3）利用OverlappingPCR将AtU3b启动子中连入带有XhoI酶切位点的接头，向非靶片段sgRNA连入带有BbsI和XbaI酶切位点的接头，经OverlappingPCR获得AtU3b启动子和非靶片段sgRNA的融合产物；分别对PMD18T-DU6-26-DCAS9载体和融合产物进行XhoIXbaI双酶切后连接，获得启动子-非靶片段sgRNA载体；再按照如下方法进行中间载体的构建：将带有酶切位点的T1-sgRNA和步骤（1）酶切后的启动子-非靶片段sgRNA载体进行连接，转化获得带有靶片段sgRNA转录的中间载体1；将带有酶切位点的T2-sgRNA和步骤（2）酶切后的启动子-非靶片段sgRNA载体进行连接，转化获得带有靶片段sgRNA转录的中间载体2；将带有酶切位点的T3-sgRNA和步骤（3）酶切后的启动子-非靶片段sgRNA载体进行连接，转化获得带有靶片段sgRNA转录的中间载体3；所述T1-sgRNA、T2-sgRNA和T3-sgRNA的核苷酸序列分别如SEQIDNO.1-3所示；所述启动sgRNA的编码DNA转录的启动子包括AtU6-1、AtU6-26和AtU3b。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 中量大黄山高质量发展研究院有限公司 一种双子叶植物多基因编辑载体及其构建方法

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD