申请/专利权人：中南大学;湖南大地同年生物科技有限公司

申请日：2023-08-24

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN117089598B

主分类号：C12Q1/6806

分类号：C12Q1/6806;C12Q1/6858

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.09#授权;2023.12.08#实质审查的生效;2023.11.21#公开

摘要：本发明开发了一种尿液免提取直接亚硫酸盐转化的甲基化检测样本前处理试剂盒及应用。通过采用特别的尿液保存液，该保存液能够在常温下有效保存尿液中的核酸，经该保存液保存的尿液无需进行离心操作富集脱落细胞，可直接通过加入磁珠富集尿液中的核酸物质，所得核酸直接进行亚硫酸盐转化。该方案既有效解决了常温运输和保存尿液样本的问题，同时省去了尿液样本离心处理过程和核酸提取纯化过程，直接进行亚硫酸盐转化后即可应用于下游qPCR或测序反应。从收到样本到亚硫酸盐转化完成，整个过程耗时小于2小时，真正实现了快速甲基化检测样本的制备。同时免提取方案也极大地降低了甲基化检测成本。

主权项：1.一种尿液免提取直接亚硫酸盐转化的甲基化检测样本前处理试剂盒在非诊断目的的检测尿液样本DNA甲基化的应用，其特征在于，包括如下步骤：1）将尿液加入保存液中，再加入用于核酸富集的磁珠，充分振荡混匀，静置后磁力吸附，弃上清，晾干后加入无核酸酶水溶解，磁力吸附后吸取含有核酸的上清液用于亚硫酸盐转化；2）取步骤1）得到的核酸溶液，加入转化液和保护液，置于PCR仪中进行反应，3）步骤2）得到的产物加入结合液和多分散硅羟基磁珠，振荡混匀，瞬时离心，磁力吸附，吸弃上清；4）加入洗涤液，振荡混匀后，瞬时离心，磁力吸附，吸弃上清；5）加入脱磺化液，常温、震荡混匀，短暂离心，磁力吸附后，去除废液；6）加入洗涤液漂洗，短暂离心，磁力吸附后吸弃废液；重复漂洗，充分晾干；7）加入洗脱液，充分混匀磁珠，56℃震荡混匀，短暂离心，磁力吸附后，将洗脱液转移在-15℃以下保存备用，或者直接进行甲基化检测；所述的试剂盒包括如下试剂：尿液保存液、核酸富集磁珠、亚硫酸盐转化试剂；所述的尿液保存液包括以下组分：离液盐、化学表面活性剂、生物表面活性剂、核酸酶抑制剂、还原剂、核酸助沉剂、低级醇、pH缓冲液，溶剂为无核酸酶的水；其中离液盐包括：硫脲和异硫氰酸胍，浓度为2-6M；化学表面活性剂包括TritonX-100，含量1%-10%；生物表面活性剂包括：枯草菌脂肽钠，含量0.1mM-10mML；核酸酶抑制剂包括：7.5mM-75mMEDTA；还原剂包括：30mM-300mM三2-羧乙基膦盐酸盐；核酸助沉剂包括：5%-25%PEG6000；低级醇包括乙醇或异丙醇，含量15%-40%；pH缓冲液包括：0.1M-0.3MpH5.4-6.8的NaAc-HAc缓冲液或0.15M-0.3MpH5.4-6.8的Tris-HCl缓冲液；核酸富集磁珠包括羟基磁珠或羧基磁珠；所述的亚硫酸盐转化试剂，包括以下组分：转化液、保护液、结合液、转化后纯化磁珠、洗涤液、脱磺化液、洗脱液；其中转化液包括4-5M亚硫酸盐，氢氧化钠调剂pH值至4.0-5.5,包括：亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵、亚硫酸钠或焦亚硫酸钠；保护液包括：2.5mM-10mM对苯二酚；结合液包括如下组分：浓度为1-4M的盐酸胍；浓度为1%-10%的Tween20；含量20%-40%的无水乙醇；2.5%-5%PEG6000；0.1M-0.2MpH6.6的NaAc-HAc缓冲液或pH6.6的0.1M-0.2MTris-HCl缓冲液；5mM-50mMEDTA；转化后纯化磁珠是多分散硅羟基磁珠，粒径为300-500nm；合成方法：首先通过共沉淀法合成出磁性四氧化三铁，然后以四氧化三铁作为磁核，表面进行硅基化修饰处理后得到；洗涤液包括如下组分：含量70%-80%乙醇、10mM-100mMpH7.5的Tris-HCl缓冲液、50-200mM氯化钠；脱磺化液包括如下组分：含量50-80%乙醇、0.28-0.32MNaOH、0.5%-5%PEG6000、0.05-0.5MNaCl、浓度为0.5%-2%的Tween20、0.5%-2%的N-月桂酰肌氨酸钠盐；洗脱液为10mM的pH8.0的Tris-HCl和0.1mMpH8.0的EDTA。

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