申请/专利权人：北京林业大学

申请日：2020-01-14

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN111154793B

主分类号：C12N15/70

分类号：C12N15/70;C12N15/10

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.09#授权;2020.06.09#实质审查的生效;2020.05.15#公开

摘要：本发明公开了基于CRISPR技术对大肠杆菌基因进行定点突变的方法。本发明方法包括：利用自身的同源重组系统结合pKOV质粒，将大肠杆菌基因组中靶基因替换为抗性标记基因，得到重组大肠杆菌；利用CRISPRCas9系统和λ‑Red同源重组系统，将重组大肠杆菌基因组中的抗性标记基因替换为带有突变位点的靶基因。本发明建立了一种高效、简单的将大肠杆菌传统基因编辑技术与CRISPR系统相结合的靶基因定点突变方法。该过程建立的重组质粒pSGKP‑km‑spacer，可以应用于其它靶基因的定点突变。一方面，大大缩短了实验操作；另一方面，为后续实现大量靶基因定点突变研究奠定了基础。

主权项：1.一种对大肠杆菌基因组中靶基因进行定点突变的方法，包括如下步骤：A利用自身所携带的同源重组系统将大肠杆菌基因组中靶基因替换为抗性标记基因，得到重组大肠杆菌；B利用CRISPRCas9系统和λ-Red同源重组系统，将A中所述重组大肠杆菌基因组中的所述抗性标记基因替换为带有突变位点的所述靶基因；步骤A中，所述重组大肠杆菌是按照包括如下步骤的方法获得的：将重组载体A通过电击法导入大肠杆菌感受态细胞，经培养、筛选获得所述重组大肠杆菌；所述重组载体A为含有DNA片段A的重组质粒；所述DNA片段A自5’端到3’端依次为所述靶基因的上游同源臂、所述抗性标记基因，以及所述靶基因的下游同源臂；所述重组载体A为将所述DNA片段A克隆到pKOV质粒中后所得；步骤B中，利用CRISPRCas9系统和λ-Red同源重组系统，将所述重组大肠杆菌基因组中的所述抗性标记基因替换为带有突变位点的所述靶基因，是通过向所述重组大肠杆菌中导入重组载体B和载体C实现的；其中，所述重组载体B通过热激法导入大肠杆菌，所述载体C通过电击法导入大肠杆菌；所述重组载体B为含有DNA片段B1和DNA片段B2的重组质粒；所述DNA片段B1为针对所述抗性标记基因的sgRNA识别区域序列；所述DNA片段B2自5’端到3’端依次为所述靶基因的上游同源臂、带有所述突变位点的所述靶基因，以及所述靶基因的下游同源臂；所述抗性标记基因为氨苄青霉素抗性基因；所述重组载体B为将所述DNA片段B1和所述DNA片段B2克隆到pSGKP-km质粒后所得；所述载体C为用于表达Cas9蛋白和λ-Red重组酶的质粒；所述载体C为pCasKP-apr质粒；所述重组载体A为将pKOV质粒的NotⅠ和BamHⅠ酶切位点之间的小片段替换为所述DNA片段A后所得的重组质粒；所述重组载体B为在pSGKP-km质粒的两个BsaⅠ酶切位点之间插入所述DNA片段B1，使用BamHⅠ单酶切之后，连接所述DNA片段B2后所得的重组质粒；所述靶基因为yjjw基因，所述yjjw基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；所述DNA片段A的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；所述DNA片段B1的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述DNA片段B2的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。

全文数据：

权利要求：

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