申请/专利权人：中山大学孙逸仙纪念医院

申请日：2020-08-31

公开（公告）日：2024-04-09

公开（公告）号：CN114107449B

主分类号：C12Q1/6851

分类号：C12Q1/6851

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.09#授权;2022.03.18#实质审查的生效;2022.03.01#公开

摘要：本发明公开了一种单细胞内原位qPCR方法。本发明的方法包括如下步骤：1将细胞消化，吹打成为单细胞悬液，去上清，将细胞沉淀重悬，加入甲醛溶液进行固定，之后加入Triton溶液进行打孔，去上清，将细胞沉淀重悬；2采用分子信标探针进行探针法RT‑qPCR。本发明的qPCR方法能看到单个细胞层面表达量的差异；不用将细胞分为单个细胞，不裂解细胞，而是让qPCR试剂和探针进入细胞内部，在细胞内部进行qPCR反应，方法简便快捷易操作。

主权项：1.一种单细胞内原位qPCR方法，其特征在于包括如下步骤：（1）将细胞消化，吹打成为单细胞悬液，去上清，将细胞沉淀重悬，加入甲醛溶液进行固定，之后加入Triton溶液进行打孔，去上清，将细胞沉淀重悬；（2）采用分子信标探针进行探针法RT-qPCR；步骤（1）中所述的甲醛溶液在体系中的浓度为1%；步骤（1）中所述的Triton溶液在体系中的浓度为0.2%；步骤（1）中所述的固定的时间为10min；步骤（1）中所述的打孔的时间为3min；步骤（2）中所述的分子信标探针为CYR61分子信标探针，其核苷酸序列如下：5'-CCAGCGCAGCCCTGCGACCACACCAACGCTGG-3'；其中，分子信标探针5'端修饰有荧光基团FAM，3'端修饰有淬灭基团BHQ1；所述的CYR61分子信标探针的引物序列如下：Primer-L：5'-AACGAGGACTGCAGCAAAAC-3'；Primer-R：5'-ACAGGGTCTGCCCTCTGAC-3'；步骤（2）中所述的分子信标探针的用量按照其在体系中浓度为1μM配比；所述的RT-qPCR使用的细胞的用量为10μLRT-qPCR体系中细胞的数量为1000-10000个；所述的方法用于检测RNA。

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权利要求：

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