申请/专利权人：无锡代际生物科技有限公司;浙江大学苏州工业技术研究院

申请日：2021-12-30

公开（公告）日：2024-04-05

公开（公告）号：CN114295596B

主分类号：G01N21/64

分类号：G01N21/64;G01N21/01

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.05#授权;2022.04.26#实质审查的生效;2022.04.08#公开

摘要：本发明公开了一种精子质量多参数检测试剂盒，包括：偶联有荧光标记物的AnnexinV复合物、溴化乙锭染料、吖啶橙染料、酸化液和缓冲液；所述荧光标记物为可在波长为200‑400nm的激发光的激发下产生绿色荧光的碳量子点。本发明能够检测包括精子活率、DNA碎片率在内的多种精子质量参数，特别的，本发明能够对坏死细胞、凋亡细胞、活细胞进行区分，并实现精子活细胞中的DNA碎片率的检测，得到更具参照价值的检测结果进一步的，本发明还能够实现精子活性氧水平的检测；本发明藉由AnnexinV复合物中的碳量子点能够清除ROS且荧光会因此而衰弱的特点，能够结合流式细胞仪实现精子活性氧水平的检测。

主权项：1.一种精子质量多参数检测试剂盒，其特征在于，包括：偶联有荧光标记物的AnnexinV复合物、溴化乙锭染料、吖啶橙染料、酸化液和缓冲液；所述荧光标记物为可在波长为200-400nm的激发光的激发下产生蓝色荧光的碳量子点；所述碳量子点通过以下步骤制备得到：1-1将番茄红素、二硫苏糖醇溶于乙醇和水的混合溶液中，超声搅拌至澄清，再加入乙二胺，搅拌；1-2将步骤1-1得到的溶液转移到聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，在烘箱中加热至130℃-160℃下持续反应4-12小时；1-3反应结束后，待产物冷却至室温，再用滤膜过滤产物，将滤液冷冻干燥得到粗产品；1-4将粗产品溶于超纯水中，离心，取滤液用截断分子量为800-1500Da的透析袋透析8-16小时，收集透析袋内溶液，冷冻干燥，即得所述碳量子点；偶联有荧光化合物的AnnexinV复合物通过以下步骤制备得到：2-1将碳量子点加入到PBS缓冲液中，搅拌溶解，然后加入EDC和NHS，活化；2-2将AnnexinV试剂加入到步骤2-1得到的溶液中，摇床反应，反应产物纯化后得到该AnnexinV复合物溶液；使用该试剂盒对精子质量进行检测的方法包括以下步骤：S1、用缓冲液将精子样品稀释，得到精子稀释液；S2、将AnnexinV复合物溶液加入到步骤S1得到溶液中，混匀后孵育；S3、向步骤S2得到的混合物中加入溴化乙锭染料，混匀后孵育；S4、向步骤S3得到的产物中加入缓冲液，混匀，然后加入酸化液，处理后加入吖啶橙染料，混匀得到待测试样；S5、利用流式细胞仪对待测试样进行检测，收集待测试样的蓝色、橙红色、绿色和红色荧光；S6、结合四种荧光检测结果进行分析：先通过蓝色荧光分析出细胞膜保持完整的凋亡细胞的比例，通过橙红色荧光分析出细胞膜损坏的坏死细胞的比例，从而得到细胞活率；在上述基础上，根据绿色荧光和红色荧光分析得到活精子细胞中的DNA碎片率；所述步骤S2中，先利用流式细胞仪检测AnnexinV复合物的蓝色荧光强度F1，然后将AnnexinV复合物加入到步骤S1得到产物中，混匀后孵育；所述步骤S6中，还根据待测试样的蓝色荧光的强度F2与AnnexinV复合物溶液的蓝色荧光强度F1的差值分析出精子的ROS含量。

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