申请/专利权人：杭州杰毅生物技术有限公司

申请日：2023-12-28

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN117867663A

主分类号：C40B50/06

分类号：C40B50/06;C12Q1/689;C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12N15/74;C40B40/08;C12R1/32

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.04.30#实质审查的生效;2024.04.12#公开

摘要：本发明公开了一种基于Tn7‑like转座子构建特异性文库的方法：1针对待检测病原体，在基因组保守区域内，针对一个以上的保守序列，设计多个PAM序列为NGTN的特异性targetDNA和多个sgRNA，多个targetDNA按照正向targetDNA和反向targetDNA交替设置；2将插入片段LE‑接头A‑接头B‑RE构建重组载体；3重组载体在CRISPR‑Cas系统中，与核酸样本进行转座反应，将插入片段插入保守序列中；CRISPR‑Cas系统包括纯化后的cas12K蛋白、tnsB、tnsC、tniQ蛋白、多个sgRNA、重组载体、核酸样本；4进行PCR扩增，得到两端分别为接头A和接头B的DNA片段，扩增产物纯化得到特异性文库。特异性文库可用于检测病原体，本发明可检测多个靶点，检测灵敏度高，排除了PCR非特异性扩增带来的假阳性影响，有良好的应用前景。

主权项：1.一种基于Tn7-like转座子构建特异性文库的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：1针对待检测病原体，在基因组保守区域内，针对一个以上的保守序列，设计多个PAM序列为NGTN的特异性targetDNA；并根据targetDNA设计能与targetDNA结合的多个sgRNA；targetDNA包括正向targetDNA和反向targetDNA，正向targetDNA在保守序列中5’端到3’端位置顺序为PAM-targetDNA，反向targetDNA在保守序列中5’端到3’端为targetDNA-PAM；按5’端到3’端的顺序，多个targetDNA按照正向targetDNA和反向targetDNA交替设置；2设计插入片段的序列，如下所示：LE-接头A-接头B-RE，将插入片段插入克隆载体得到重组载体；LE为Tn7-like转座子左端，RE为Tn7-like转座子右端；3重组载体在Tn7-like转座子构建的CRISPR-Cas系统中，与核酸样本进行转座反应，利用Cas12K的定向插入功能，将插入片段LE-接头A-接头B-RE插入基因组保守区域的保守序列中；所述CRISPR-Cas系统包括纯化后的cas12K蛋白、tnsB、tnsC、tniQ蛋白、多个sgRNA、重组载体、核酸样本；4对含有插入片段的核酸进行PCR扩增，得到两端分别为接头A和接头B的DNA片段，扩增产物纯化得到特异性文库。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 杭州杰毅生物技术有限公司 一种基于Tn7-like转座子构建特异性文库的方法及应用

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