申请/专利权人：中南大学;中国矿业大学

申请日：2022-02-28

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN114622004B

主分类号：C12Q1/686

分类号：C12Q1/686;C12Q1/64;C12Q1/10;C12N15/70;C12N15/65;C12N1/21;G01N21/64;G01N15/08;G01N33/22;C12R1/19

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.12#授权;2022.07.01#实质审查的生效;2022.06.14#公开

摘要：一种煤岩液相流生物核酸探针示踪方法，属于煤岩层水力示踪测试评价方法。以人工编辑荧光蛋白表达质粒转化示踪菌作为示踪介质，利用示踪菌随液体自由扩散和在煤体表面单层吸附特性完成菌种在介孔的分布，示踪菌携带有特异性绿色荧光蛋白核酸探针，该核酸探针与PET22b表达质粒进行重组融合并且可以随着示踪菌的生长而自主复制表达，以生物核酸探针扩增方法实现示踪菌分布的定性定量分析，准确判断煤层裂系的走向。优点：利用大肠杆菌为示踪介质，借助大肠杆菌个体小个体尺寸5μm并且不可继续分割、携带特种易辨识DNA片段，具备荧光特征、菌体可通过离心实现浓缩、具备敏感因子自主躲避特性。

主权项：1.一种煤岩液相流生物核酸探针示踪方法，其特征在于：以人工编辑荧光蛋白表达质粒转化示踪菌作为示踪介质，利用示踪菌随液体自由扩散和在煤体表面单层吸附特性完成菌种在介孔的分布，示踪菌携带有特异性绿色荧光蛋白核酸探针，该核酸探针与PET22b表达质粒进行重组融合并且随着示踪菌的生长而自主复制表达，以生物核酸探针扩增方法实现示踪菌分布的定性定量分析，准确判断煤层裂隙的走向；具体步骤如下：步骤1、人工合成EGFP和Mchery生物核酸探针并与商用表达质粒PET22b进行重组融合，构建含有特异性生物核酸探针的PET22b-EGFP、PET22b-Mchery重组融合表达质粒；以大肠杆菌为载体，转化人工编辑的含有生物核酸探针的重组融合表达质粒并进行诱导表达，将大肠杆菌改造为含有特异性生物核酸探针的示踪菌，所述大肠杆菌的菌种编号：E.coilBL21；步骤2、初步将示踪菌的菌群密度培育至1×108～1×109个mL，完成示踪菌种子液的制备；步骤3、综合水力化措施预估处理煤岩体体量、孔隙率、孔隙比表面积估算出水力化措施示踪菌液需求量LHE和水力化措施示踪菌液的菌密度ρE；步骤4、以示踪菌种子液为菌源，根据步骤3计算结果培育并诱导表达水力化措施示踪菌液，并用相应激发波长照射示踪菌液检验示踪菌是否培育成功；菌剂注入完成后静置48-72小时，利用示踪菌自由扩散特性完成菌种在煤体介孔裂隙空间的布置，使示踪菌吸附在煤裂隙表面并逐渐稳定；步骤5、根据设计好的空间取样点布置，钻孔取样，取样时采用无菌硅胶取样器孔底取样，每个孔煤样取样量3g；步骤6、利用荧光显微镜观察示踪菌随液体自由扩散和在煤体样品表面单层吸附特性完成菌种在介孔的分布分析；步骤7、根据煤孔隙大肠杆菌粘滞系数和煤样有效比表面积，评估菌种最大扩散半径，划分五个范围区域，并设计空间取点布置；五个范围区域具体为示踪菌高丰度半径、示踪菌中丰度半径、示踪菌低丰度半径、示踪菌微量分布半径和示踪菌痕量分布半径；步骤8、根据步骤7划定的示踪菌丰度分布，对不同丰度区域煤样的示踪菌进行提取；步骤9、生物探针法探测煤层中示踪菌的分布：利用环境微生物样品总群落基因组DNA提取试剂盒对不同空间位点的煤炭样品进行处理，提取煤样中微生物总基因组；由于示踪菌中携带有生物核酸探针，以煤样中微生物总基因组为模板，利用分子生物学技术手段进行核酸探针的特异性识别和扩增，来检测煤层中示踪菌的分布；步骤10、根据各取样点的空间坐标和各样品的计数结果绘制示踪菌三维分布等高图，分析示踪菌在煤矿裂隙中的分布；步骤11、将示踪菌分布等高图与水力化措施设计控制区域相比对，利用生物核酸探针的特异性，检测荧光菌在每层中的注入分布情况，从而准确判断煤层裂隙的走向，完成水力化措施效果评价；步骤3中，水力化措施示踪菌液需求量和水力化措施示踪菌液的菌密度；具体为LHE＝Vc×n 其中LHE：水力化措施示踪菌液需求量，单位：m3；LTE：含有特异性生物核酸探针示踪菌总需求量，单位：个；SE：含有特异性生物核酸探针示踪菌单菌投影面积，单位：μm2个；Vc：煤岩体处理体积，单位：m3；vm：孔隙比表面积，单位：m2m3；n：孔隙率；ρE：水力化措施示踪菌液的菌密度，单位：个mL；步骤7中，示踪菌高丰度半径为煤样中菌种密度1×106个g煤、示踪菌中丰度半径为煤样中菌种密度：1×105-1×106个g煤、示踪菌低丰度半径为煤样中菌种密度：1×104-1×105个g煤、示踪菌微量分布半径为煤样中菌种密度：1×103-1×104个g煤、示踪菌痕量分布半径为煤样中菌种密度1×103个g煤。步骤8中，所述的示踪菌提取方法如：1示踪菌高丰度半径、示踪菌中丰度半径、示踪菌低丰度半径范围内的大肠杆菌提取方法：1g煤样与2.5mL超纯水混合，充分震荡后3000g离心5min，取上清液1mL为提取菌液；2示踪菌微量分布半径、示踪菌痕量分布半径范围内的大肠杆菌提取方法：3g煤样与7.5mL超纯水混合，充分震荡后3000g离心5min，取上清液5mL，然后将5mL上清液15000g离心10min，弃上清液，留浓缩菌液0.5mL为浓缩提取菌液；示踪菌具备非团聚性特征，是菌种自身具备的一种菌间不粘附的特征；当一菌株在煤体吸附表面形成占位后，其他菌株不会吸附在已吸附的示踪菌表面，由此特性使示踪菌在煤体表面形成的菌膜具备单一菌层特征，即单层吸附；示踪菌具备如下技术特征：1示踪菌经过荧光蛋白表达载体转化，经诱导表达特异性蛋白后，携带有荧光特征；2示踪菌本身具备双波长激发荧光特征，两种激发光的波长差≥100nm；被激发的荧光光谱范围限制在400nm-800nm，并且两种被激发的荧光波长差≥100nm；3示踪菌来源于非煤地质环境的自然界，确保示踪菌与煤层菌种具备显著DNA差异；4示踪菌自身具有运动特征、有显著的敏感因子趋避特性，能够自主向低敏感因子环境移动的能力；5示踪菌的菌株直径小于2μm，长度小于6μm。

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