申请/专利权人：江苏先声医学诊断有限公司;江苏先声医疗器械有限公司;南京先声医学检验实验室有限公司

申请日：2023-07-31

公开（公告）日：2024-04-12

公开（公告）号：CN117126920B

主分类号：C12Q1/6806

分类号：C12Q1/6806

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.12#授权;2023.12.15#实质审查的生效;2023.11.28#公开

摘要：本申请属于微生物检测领域，具体提供一种基于纳米孔测序平台中枢神经感染脑脊液样本病原体的建库和检测方法。本方法结合纳米孔测序平台优势，将快速PCR条码试剂盒和PCR‑cDNA条码试剂盒联合使用一并混库上机，成功搭建基于纳米孔测序平台的中枢神经感染病原体建库和检测方法，既满足低起始量脑脊液样本的宏基因组检测需求，又显著提高脑脊液样本难检病原体检出的灵敏度。

主权项：1.一种基于纳米孔测序平台的中枢神经感染病原体的建库方法，其特征在于，所述方法包括宏基因组流程和靶向富集流程；所述宏基因组流程包括：1）脑脊液样本前处理；2）宏基因组DNA提取；3）宏基因组文库快速制备；所述1）脑脊液样本前处理的步骤为：脑脊液样本至灭菌离心管，加3-5%质量浓度的saponin颠倒混匀；加入HL-SAN酶，混匀金属浴振荡孵育；再加EDTA涡旋混匀；所述2）宏基因组DNA提取采用Promega公司Maxwell®RSCWholeBloodDNAKit进行提取；所述3）宏基因组文库快速制备使用快速PCR条码试剂盒SQK-RPB004进行宏基因组文库快速制备；所述靶向富集流程包括：a）DNARNA共提取；b）目标病原片段PCR扩增；c）BP接头连接PCR扩增建库；所述b）目标病原片段PCR扩增中，扩增采用的DNA多重酶为ThermoPlatinum™MultiplexPCRMasterMix；所述PCR扩增体系如下：针对目标病原：真菌、细菌及DNA病毒： 组分 体积 Platinum™MultiplexPCRMasterMix，2X 25μL 靶向Primer1 0.1-0.5μMeach 靶向Primer2 0.1-0.5μMeach Template 10μL GCEnhancer 2μL Nuclease-freewater 补充至50μL 针对目标病原：RNA病毒： 组分 体积 2×OneStepHighFidelityBuffer 25μL PrimeScriptIIRTEnzymeMix 1μL PrimeSTARGXLfor1stepRT-PCR 4μL 靶向Primer3 0.1-0.4μMeach 靶向Primer4 0.1-0.4μMeach Template 10μL Nuclease-freewater 补充至50μL 所述c）BP接头连接PCR扩增建库使用PCR-cDNA条码试剂盒SQK-PCB111.24进行病原体靶向建库；建库中，接头PCR引物序列如下：上游引物：5’–TGGTGCTGATATTGC–目标病原微生物特异性引物–3’，下游引物：5’–TGTCGCTCTATCTTC–目标病原微生物特异性引物–3’；所述PCR扩增建库体系如下： 组分 体积 ThermoPlatinum™MultiplexPCRMasterMix，2X 25μL DNA 22μL 接头PCR引物 1μL GCEnhancer 2μL Nuclease-freewater 补至50μL

全文数据：

权利要求：

百度查询： 江苏先声医学诊断有限公司;江苏先声医疗器械有限公司;南京先声医学检验实验室有限公司 基于纳米孔测序平台的中枢神经感染病原体建库和检测方法

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