申请/专利权人：黄山同兮生物科技有限公司

申请日：2021-12-27

公开（公告）日：2024-04-16

公开（公告）号：CN114214352B

主分类号：C12N15/72

分类号：C12N15/72;C12N15/56;C12P19/00;C12N1/21;C12R1/19

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2024.04.16#授权;2022.04.08#实质审查的生效;2022.03.22#公开

摘要：本发明公开了一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法，包括以下步骤：先将原始pTargetF质粒改造为包含两个大肠杆菌基因组剪切位点的双J23119promoter‑N20‑gRNAscaffold结构质粒，同时在质粒上插入用于修复大肠杆菌基因组的两段同源模板及lacY基因的调控序列，得到pTargetT；在大肠杆菌本底菌株转入pCas质粒后，使用阿拉伯糖诱导表达λ‑Red重组酶，随后转入pTargetT编辑质粒，培养过夜并经过筛选后去除pTargetT和pCas质粒，完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化。本发明克服大肠杆菌自身代谢乳糖的缺陷的同时能保证乳糖作为发酵底物的充分吸收，提高乳糖在发酵过程中的利用率，本方法适用不同lac操纵子的大肠杆菌改造，增加本底菌株的可选项，节省构建菌株时的成本。

主权项：1.一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法，其特征在于，包括以下步骤：设计待敲除序列的前N20序列、后N20序列，并设计包含前N20序列的引物对、包含后N20序列的引物对；再利用包含前N20序列的引物对、包含后N20序列的引物对在pTargetF质粒中引入用于定位Cas9蛋白切割位点的双N20序列；在pTargetF质粒中引入包含lacY调控序列的重组同源模板，得到pTargetT质粒；之后将已经转入pCas质粒的本底菌株使用阿拉伯糖诱导，再转入pTargetT质粒，经过培养鉴定后消除pCas与pTargetT，完成发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化；本底菌株为lacZΔM15或lacZ基因型的大肠杆菌；前N20序列为gtcacgacgttgtaaaacga、后N20序列为caactggtaatggtagcgac；以本底菌株的基因组为模板，分别利用HDL引物对、HDR引物对进行扩增，分别得到HDL扩增产物、HDR扩增产物；将HDL扩增产物、HDR扩增产物引入pTargetF质粒中，实现在pTargetF质粒中引入包含lacY调控序列的重组同源模板；对于lacZΔM15基因型的大肠杆菌，HDL引物对为agctgtttcctgtgtgaaat、tggttgccaacgatcagatg，HDR引物对为gtaatagatctaagcttcagtgccagcttaaggctaa、tcacacaggaaacagcttctagagattaaagaggagaaatactagatgtactatttaaaaaacac；对于lacZ基因型的大肠杆菌，HDL引物对为agctgtttcctgtgtgaaat、tggttgccaacgatcagatg，HDR引物对为gtaatagatctaagcttcagtgccagcttaaggctaa、tcacacaggaaacagcttctagagattaaagaggagaaatactagatgtactatttaaaaaacac。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 黄山同兮生物科技有限公司 一种发酵乳糖的大肠杆菌基因组优化方法

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD