申请/专利权人：中国农业科学院生物技术研究所

申请日：2018-07-19

公开（公告）日：2018-11-16

公开（公告）号：CN108823133A

主分类号：C12N1/20(2006.01)I

分类号：C12N1/20(2006.01)I;C12R1/01(2006.01)N

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.08.03#授权;2018.12.11#实质审查的生效;2018.11.16#公开

摘要：本发明分离培养出一个新的微生物菌株，经鉴定确认该菌属于丝氨酸球菌属，被命名为阿勒泰丝氨酸球菌W204——Serinicoccus altayensis W204。本发明发现该菌具有耐受盐胁迫功能。该细菌可用于构建转基因生物，培育耐盐植物。

主权项：1.保藏编号为GDMCC No:60235的阿勒泰丝氨酸球菌W204Serinicoccus altayensis W204。

全文数据：耐盐阿勒泰丝氨酸球菌及其应用技术领域[0001]本发明属于微生物技术领域，涉及一种新的阿勒泰丝氨酸球菌。本发明还涉及该菌作为耐盐功能菌株方面的应用。背景技术[0002]土壤盐渍化导致全球粮食产量下降10-20%，提高作物的耐盐能力是解决这一问题最根本、最有效的方法。中国存在大量盐碱地，盐害极大的影响了植物的正常生长。从自然界现有生物资源中寻找耐盐基因，转化到植物中予以表达，从而提高植物对盐渍的忍耐力，是解决这一问题的关键。[0003]目前，已报道具有耐盐的微生物多为Deinococcus属的细菌，如耐福射异常球菌Deinococcusradiodurans，该菌中的全局调控蛋白IrrE在细胞应对盐胁迫冲击过程中发挥了重要作用。但是，目前还未有关于Serinicoccus属细菌盐胁迫冲击能力的报相关道。发明内容[0004]本发明的目的是分离出具有耐受盐胁迫能力的新种微生物。[0005]本发明人从新疆阿勒泰地区某草地土壤样品中分离培养出一种新的微生物菌种，经鉴定确认该菌种属于丝氨酸球菌属，被命名为阿勒泰丝氨酸球菌W204，SerinicoccusaltayensisW204【altay·en’sis·Ν·L.masc.adj·】。[0006]该菌种已在国家知识产权局指定的保藏单位广东省微生物菌种保藏中心保藏，保藏日期为2017年9月15日，保藏登记号为GDMCCN〇:60235。[0007]本发明发现该菌具有耐盐的功能。[0008]本发明所述的耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204S.altayensisW204具有以下特性：[0009]1、培养条件：[0010]1培养基:采用2216E琼脂培养基。具体配方为:蛋白胨5gL，酵母提取物lgL，柠檬酸铁〇.IgL，氯化钠19.45gL，氯化镁5.98gL，硫酸钠3.24gL，氯化钙1.8gL，氯化钾0.55gL，碳酸钠0.16gL，溴化钾0.08gL，氯化铯0.034gL，硼酸0.022gL，硅酸钠0·004gL，氟化钠0·0024gL，硝酸钠0·0016gL，磷酸氢二钠0·008gL，琼脂15gL。[0011]⑵pH7.4-7.8;[0012]3培养温度:37°C。[0013]2、形态特征[0014]该菌为革兰氏阳性细菌，在电子显微镜下可见为球状图1。[0015]3、在各种培养基上的特征：[0016]在2216E琼脂培养基上，菌落呈浅橙色、凸起状，表面湿润，边缘整齐，无胞外分泌物图2。[0017]在R2A琼脂培养基上长势缓慢。[0018]4、生理生化特征[0019]该菌株为严格好氧生长，革兰氏阳性，无运动性。白氨酸芳胺酶阳性，酸性磷酸酶阳性，萘酚-AS-BI-磷酸水解酶阳性，Ct-葡萄糖甙酶阳性。[0020]5、碳源利用[0021]能以糊精、D-半乳糖、D-果糖、D-果糖-6-磷酸、D-葡糖醛酸和葡糖醛酰胺等为碳源，但不能以D-棉子糖、α-D-乳糖、D-山梨醇、D-甘露醇、D-阿拉伯醇、D-丝氨酸和柠檬酸等为碳源。[0022]6、其它性质[0023]最适生长温度37°C。细胞壁脂肪酸含有C15=OanteisC1X15=Oisc1XiOisoXmnteis。和C14:Ois。等，其中以Cl5:Oanteis。和Cl5:Oiso为王。[0024]7、与同属菌的16SrDNA对比：[0025]本发明发现的耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204的16SrDNA与同属的其它种相比，相似度均〈97%。即有显著差异：[0026]与SerinicoccusprofundiDSM21363τ的相似度为97·04%;[0027]与SerinicoccuschungangensisCAU95361¾相似度为96.23%;[0028]与SerinicoccusmarinusDSM15273τ的相似度为96.01%。[0029]耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204与其它丝氨酸球菌属成员之间的进化关系（基于16SrDNA序列分析见图3系统发育树。[0030]8、与丝氨酸球菌属标准菌株微生物学特性比较：[0031]与丝氨酸球菌属标准菌株------SerinicoccusmarinusDSM15273τ等的对比实验表明，本发明发现的耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204与该属标准菌株的微生物学特性有显著差异表1。[0032]表1阿勒泰丝氨酸球菌W204与已报道的同属菌株的微生物学特性比较[0033][0034]注：“+”表示阳性，表示阴性，“W”表示弱阳性，ND表示无相关数据[0035]9、耐盐功能鉴定[0036]本发明所述的耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204具有较好的耐盐功能，经实验证实（见实施例2能够在经过5MNaCl冲击8h后正常生长图4。[0037]通过对其耐盐抗性机理的研究，可以更好地阐明该菌的抗逆特性，进一步加深人们对于盐胁迫耐受机理的认识。也可作为新的转基因生物的基因供体，将其优良的耐盐基因转入其它生物体中，使其获得优良的抗逆性状。[0038]同时，该菌作为新的基因工程菌株，接受外来的其它优良形状基因；此外，还可通过传统的诱变育种手段，获得更多性状优良的耐盐的优质作物品系，促进盐碱土地的改良利用，具有重要的应用价值。附图说明[0039]图1耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204的扫描电镜图片；[0040]图2耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204的菌落形态；[0041]图3耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204与其它丝氨酸球菌属成员之间的进化分析基于16SrDNA序列分析）；[0042]图4耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204与对照菌株E.colitrans109对氯化钠的耐受对比：左图为对照菌株E.colitrans109在不同浓度NaCl及不同时间冲击下的生长情况，右图为阿勒泰丝氨酸球菌W204在不同浓度NaCl及不同时间冲击下的生长情况；[0043]生物材料保藏信息：[0044]名称：阿勒泰丝氨酸球菌W204SerinicoccusaltayensisW204[0045]保藏编号:GDMCCNo:60235[0046]保藏单位:广东省微生物菌种保藏中心保藏地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所[0047]保藏时间：2017年9月15日。[0048]序列信息[0049]SEQIDNO:1:阿勒泰丝氨酸球菌W204的16SrDNA核苷酸序列。具体实施方式[0050]实施例1阿勒泰丝氨酸球菌W204的获得[0051]于新疆阿勒泰地区某草地采集土壤样品，称取Ig土样，加入20mLTGY培养基中于30°C、200rpm下富集培养112h。[0052]取富集培养物100yL，按照^^^、…'^^^和⑺^依次梯度稀释^别取200yL涂布于R2A琼脂培养基平板上，倒置于30°C培养箱中培养几天，委托广东省微生物菌种保藏中心对分离到的菌株进行鉴定，确认该菌种属于丝氨酸球菌属，命名为耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204。[0053]所述R2A琼脂培养基成分：[0054]R2A琼脂培养基:酪蛋白水解物0.5gL;酵母提取物0.5gL;胰蛋白胨0.5gL;葡萄糖0.5gL;可溶性淀粉0.5gL;磷酸氢二钾0.3gL;无水硫酸镁0.024gL;丙酮酸钠0.3gL;氯化钠l〇gL;琼脂lSgLpH7.0-7.4。[0055]培养温度为37Γ。[0056]实施例2阿勒泰丝氨酸球菌W204的耐盐实验氯化钠耐受试验）[0057]1、试验方法[0058]将本发明所述的耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204菌液培养到OD6qq=O.5,通过，4000Xg、lmin、4°C离心收集菌体;后将菌体重悬于等体积4M和5MNaCl，之后30°C，200rpm培养10!!^11、411、611、811。在相应的时间点取样，并依次稀释为10_1、10_2、10_3、10_4和10_5。每个浓度梯度取8yL点在2216E琼脂培养基上，37°C倒置培养，观察结果。[0059]同时以OD6〇q=0.5的大肠杆菌Transl09E.colitrans109菌株为对照。[0060]试验菌和对照菌各进行3次平行实验。[0061]2、结果[0062]实验结果表明，本发明的耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204在4M和5MNaCl冲击4h、6h、8h后仍旧能正常生长，和未处理菌株并未表现出差异。而对照菌株E.colitrans109在4MNaCl冲击IOmin后，其生长较未处理菌株相差两个数量级，4M和5MNaCl冲击4h后相差四个数量级，而冲击6h、8h后，则几乎不能生长图4。[0063]实施例3阿勒泰丝氨酸球菌16SrDNA的提取[0064]本发明还提供了耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204的基因组提取、16SrDNA的扩增及测序方法，具体按照下述操作进行：[0065]1.基因组提取方法[0066]本发明所述的耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204基因组使用MAGENOR公司的细菌基因组DNA提取试剂盒离心柱型进行提取，详见其说明书。[0067]2.PCR扩增方法[0068]本发明所述的耐盐阿勒泰丝氨酸球菌W204的16SrDNA的PCR扩增所用的通用引物序列的设计参照WilliamG.Weisburg1991的文章，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。扩增所用的试剂盒购买自南京诺唯赞生物科技有限公司。[0069]正向引物27F5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’），[0070]反向引物1492R5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’），[0071]表2PCR扩增体系[0072][0073]PCR反应程序[0075]将扩增得到的16SrDNA序列，连接于Themio®公司的pJET1.2blunt载体上，委托北京六合华大基因科技有限公司对于插入序列进行测序。[0076]测序得到的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

权利要求：1.保藏编号为^]^^1'1〇:60235的阿勒泰丝氨酸球菌？204361'；[11；[3〇^1183]^5^11818W204〇2.权利要求1所述的阿勒泰丝氨酸球菌W204作为耐盐功能菌株方面的应用。3.权利要求1所述的阿勒泰丝氨酸球菌W204在构建耐盐转基因生物方面的应用。4.权利要求1所述的阿勒泰丝氨酸球菌W204在诱变育种和改良植物耐盐性状方面的应用。

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