申请/专利权人：新疆农业大学

申请日：2017-12-28

公开（公告）日：2018-05-18

公开（公告）号：CN108048577A

主分类号：C12Q1/6888(2018.01)I

分类号：C12Q1/6888(2018.01)I;C12Q1/6851(2018.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的视为撤回

法律状态：2022.03.11#发明专利申请公布后的视为撤回;2018.09.25#著录事项变更;2018.06.12#实质审查的生效;2018.05.18#公开

摘要：本发明公开了含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，利用绵羊SEC62基因的mRNA序列自行人工设计特异性引物，正向引物：5'‑GATAGCAGCCACCCTCTTCC‑3'；反向引物：5'‑ACGAGCAACAGCAAGGAGAA‑3'，以样本基因组DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物进行荧光定量PCR检测，并将其表达量与蛋白质和氨基酸含量进行关联分析，以此来选育提高阿勒泰羊的肉品质；本发明的建立，在为选育阿勒泰羊优良品种，提供分子辅助育种的理论基础和技术支持的同时，对于保护阿勒泰羊的优良品种资源、提高农牧民经济收入、加快肉羊业发展具有实际应用价值。

主权项：含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：（1）特异性引物：SEC62特异性引物：上游引物F：5'‑GATAGCAGCCACCCTCTTCC‑3'；下游引物R：5'‑ACGAGCAACAGCAAGGAGAA‑3'；（2）cDNA模板；（3）荧光定量PCR反应液和无RNA酶水。

全文数据：含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒技术领域[0001]本发明涉及动物遗传选育的鉴定方法，具体的，本发明涉及一种阿勒泰羊产肉性能选育的试剂盒的技术领域。背景技术[0002]阿勒泰羊，为新疆地方优秀肉羊品种，是古老的哈萨克绵羊品种中的一个分支品系，早在公元前后为哈萨克的祖先乌孙人所饲养。羔羊具有突出的早熟特征，适于羊肉生产，属肉、脂兼用品种。阿勒泰羊的主要产区集中在新疆北部的阿勒泰地区福海县、富蕴县、清河县等地，分布在阿勒泰、布尔津、吉木乃及哈巴河等县，但是随着引种和场间及区间交流，阿勒泰现在在全疆基本都有分布。阿勒泰羊体格大，体质结实。胸宽深，背平直，肌肉发育良好。四肢高而结实，股部肌肉丰满。其突出性状主要体现在产肉性状上，并且阿勒泰羊体格大、肉脂生产性能高，具有耐粗饲、善跋涉、抗严寒、体质坚实、适宜放牧等特点。阿勒泰羊属大型的肉羊品种，与国内各牧区的羊种比较，也略胜一筹。新疆区内的地方良种巴什拜羊、巴音布鲁克羊及区外良种的蒙古羊，包括其亚型如滩羊、寒羊、同羊、湖羊等，平均活重都低于阿勒泰羊。阿勒泰羊已经作为我区畜牧业畜种结构中的主要品种。阿勒泰羊种地处常年低温，冬季长达近半年，且最冷可达-35至-40°c，由于自然条件恶劣，许多优良品种在这里无法生存，而阿勒泰羊就是在这样一个特殊的条件下，通过长期的自然和人工选择而形成的，如何选育提高阿勒泰羊产肉性能，是加快提高恢复阿勒泰羊优良产肉性能的关键，这实际上是本领域目前普遍存在的共性问题，如何解决迫在眉睫。[0003]在畜禽肉品的蛋白质中，氨基酸的种类和含量比例对蛋白质营养价值起着至关重要的作用。羊肉营养丰富，蛋白质含量高，营养价值高，并含有丰富的氨基酸，跟猪肉、牛肉非常接近，肉质细嫩易消化和吸收，国内外学者通过对羊肉蛋白质和氨基酸的分析，山羊肉中具有很多的氨基酸。猪肉营养价值的重要评价指标是肉中氨基酸含量和组成，也是肉品质的重要影响因素。而氨基酸含量中甘氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和谷氨酸等6种鲜味氨基酸是形成肉品香味所必需的前体氨基酸，跟肉的风味有很大的联系，特别是鲜味物质谷氨酸，可以中和咸与酸，使肉变得更加鲜美。[0004]目前，在国内外关于SEC62基因的研究多见于人类和小鼠中，在绵羊中鲜有报道，以及基于目前对于福海大尾羊，即对于阿勒泰羊特殊新疆典型性品种肉质改良的特殊性，现有技术尚未见到将SEC62基因作为影响家畜肉质性状的候选基因在阿勒泰羊产肉性能选育中的应用。发明内容[0005]针对现有技术中未见报道专门针对SEC62基因在阿勒泰羊产肉性能选育中应用及阿勒泰羊品种的特殊性的技术现状，本发明旨在于提供含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，用于提高阿勒泰羊产肉性能。[0006]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：[0007]本发明提供含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，试剂盒包括：[0008]1特异性引物：[0009]SEC62特异性引物：[0010]上游引物F:5’-GATAGCAGCCACCCTCTTCC-3’；[0011]下游引物R:5’-ACGAGCAACAGCAAGGAGAA-3’。[0012]2cDNA模板。[0013]3荧光定量PCR反应液和无RNA酶水。[0014]优选的，所述的试剂盒包括2.5XRealMasterMixlOyl，上下游引物各0.4μ1，cDNA模板1·5μ1。[0015]进一步，本发明提供含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒的应用，包括以下步骤：[0016]ICDNA提取:采取阿勒泰羊血样5ml，提取RNA，在-80°C保存;反转录为CDNA，用内参基因ACTB进行PCR扩增。[0017]2SEC62基因PCR扩增:特异性扩增SEC62基因的两个片段;反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s、退火温度30s、72°C延伸lmin，循环31次，72°C延伸5min，4°C保存。[0018]3荧光定量PCR检测：在96孔板中分别加入一下荧光定量PCR反应体系：2.5XRealMasterMixSYBRGreen10μ1，上下游引物各0.4μ1，cDNA模板1.5μ1，加水至总体积20μ1;循环条件为95°C预变性30s;95°C变性5s;60°C退火30s共42个循环;最后在95°C10s、65°C5s、94°C5s，作熔解曲线。[0019]4基因表达量与蛋白质含量及氨基酸含量的关联分析:对SEC62基因在阿勒泰羊股四头肌中的表达量与必须氨基酸含量进行显著性检验。[0020]本发明中，阿勒泰羊SEC62基因特异性引物设计中，通过国际分子生物信息网站NCBINationalCenterforBiotechnology，检索得到绵羊SEC62基因和的cDNA序列GenBank登录号：SEC62:NM_004003175.3，借助公知软件Primer5.0，自行人工设计特异性引物，引物序列自行进行合成。[0021]通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果：[0022]1本发明提供的含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，并经过分析自行设计引物，扩增分析得到阿勒泰羊背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力相关系数为0.8-1.0,极强相关;其它品种羊背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力相关系数为〇.〇_〇.2,无明显相关性，说明本发明提供的含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒具有较好的特异性。[0023]2本发明通过提供含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒经过应用，对新疆阿勒泰羊SEC62基因的表达量进行检测，在阿勒泰羊群体中，SEC62基因的表达量与阿勒泰羊的肉质显著相关，P〈〇.05;这一结果表明，SEC62基因可作为阿勒泰羊影响肉质的一个分子标记，本发明提供的含SEC62基因的检测试剂盒用于选育提高阿勒泰羊的肉质性能具有实用性。本发明的建立，在为选育阿勒泰羊优良品种，提供分子辅助育种的理论基础和技术支持的同时，对于保护阿勒泰羊的优良品种资源、提高农牧民经济收入、加快新疆肉羊业发展具有实际应用价值。附图说明[0024]图1为总RNA产物电泳图。[0025]图2为PCR扩增产物电泳图，图中，M为DL2000DNAMarker，泳道1-10为PCR扩增产物。[0026]图3为SEC62基因的熔解曲线图。具体实施方式[0027]下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中的设备和材料有：[0028]采用的主要原材料及相关试剂等:TrizolTotalRNAReagent总RNA提取试剂由北京天根公司提供；VACUETTE®ZSerumClotActivator真空采血血清管由奥地利GreinerBio-One公司提供；2XTaqPCRMasterMix由博迈德生物（PC0912提供；DL2000DNAMarker由庄盟生物ZM404-1提供;EB由新疆宝信提供。[0029]主要仪器设备:TG16-W微量高速离心机产自长沙湘仪离心机仪器有限公司；DYCZ-24F型电泳槽和DYY-6C型电泳仪产自北京市六一仪器厂;AL204-IC电子天平产自梅特勒-托勒多仪器厂上海有限公司;JY04S凝胶成像仪产自北京君意东方电泳设备有限公司；恒温箱恒温水浴振荡器产自北京桑翌实验仪器研究所。[0030]本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。[0031]实施例一：[0032]本发明提供含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，试剂盒包括：[0033]1特异性引物：[0034]SEC62特异性引物：[0035]上游引物F:5，-GATAGCAGCCACCCTCTTCC-3，；[0036]下游引物R:5’-ACGAGCAACAGCAAGGAGAA-3’。[0037]2cDNA模板。[0038]3荧光定量PCR反应液和无RNA酶水。[0039]其中包括2.5XRealMasterMixlOyl，上下游引物各0.4yl，cDNA模板1.5μ1。[0040]实施例二：[0041]I、基因组RNA提取：[0042]采集待测阿勒泰羊颈静脉血液5ml，枸橼酸钠抗凝，液氮保存；[0043]提取RNA，在-80°C保存;反转录为cDNA，用内参基因ACTB进行PCR扩增。[0044]配制0.8%琼脂糖凝胶:琼脂糖0.8g，溶于100ml0.5XTBE，微波炉加热至充分熔解，待降至室温后倒入插有梳子的胶槽内，冷却凝固后待用。[0045]利用配制的0.8%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压100V，电流50mA，电泳30分钟。经溴化已锭染色15分钟后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，参见附图1所示，观察条带的大小和亮度，判断cDNA的提取质量。[0046]2、PCR扩增：[0047]1引物设计及合成[0048]根据绵羊SEC62基因的mRNA序列¢enBank登录号：SEC62:NM_004003175.3，利用软件Primer5.0独立设计引物，引物自行设计合成。设计的引物的序列分别为：[0049]上游引物序列F:5’-GATAGCAGCCACCCTCTTCC-3’，[0050]下游引物序列R:5’-ACGAGCAACAGCAAGGAGAA-3’；扩增片段大小为155bp，碱基参见附后提供的基因序列表。[0051]2PCR扩增反应体系及程序优化[0052]根据设计的引物，特异性扩增SEC62基因的两个片段。PCR反应体系为:Mix10.0μI，上下游引物各0.4μ1，DNA模板1.5μ1，加水至总体积20μ1;反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s、退火温度30s、72°C延伸lmin，循环31次，72°C延伸5min，4°C保存。[0053]对PCR扩增反应程序的退火温度进行优化。在其他反应条件不变的情况下，在PCR仪上对退火温度设置梯度，梯度范围为55°C-65°C，即平均每个板孔变化温度为1°C。经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察扩增条带的亮度和纯度，最终确定引物的最适退火温度为60cC〇[0054]特异性扩增的产物由1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电压100V，电泳30min，经溴化已锭EB染色15min后，于Bio-RAD凝胶成像仪紫外灯下照射，观察扩增条带的大小和亮度，判断PCR产物扩增质量。结果参见附图2。[0055]3、荧光定量PCR检测：[0056]在96孔板中分别加入一下荧光定量PCR反应体系：2.5XRealMasterMixSYBRGreen10μ1，上下游引物各0.4μ1，cDNA模板1.5μ1，加水至总体积20μ1;整个反应在BIO-RAD荧光定量PCR序列扩增仪中进行，循环条件为95°C预变性30s;95°C变性5s;60°C退火30s共42个循环;最后在95°CIOs、65°C5s、94°C5s，作熔解曲线，如附图3所示。为保证特异性的扩增，要求得到的熔解曲线只有一个峰。[0057]4、关联分析：[0058]利用软件SPSS20.0,将基因的表达量与蛋白质和氨基酸含量进行关联分析检验，结果如下表1:[0059]表1:阿勒泰羊SEC62基因的表达量与蛋白质和氨基酸含量关联分析[0060][0061]注表示显著相关P〈0.05。[0062]从表1可以看出，在新疆阿勒泰羊群体中，SEC62基因的表达量与阿勒泰羊的肉质显著相关，P〈〇.05;这一结果表明，SEC62基因可作为阿勒泰羊影响肉质的一个分子标记，本发明提供的含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒具有实用性。[0063]实施例三：[0064]基于实施例二，采用上述实施例提供的含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒应用于小鼠、小尾寒羊、卡拉库尔羊、和田羊、哈萨克羊、巴音布鲁克羊中，观测SEC62基因在其背最长肌中的表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力的关联度。具体见表2:[0065]表2:SEC62基因表达量与部分肉品质指标的相关系数[0066][0067]注:0.0-0.2无相关，0.4-0.6中等程度相关，0.8-1.0极强相关。[0068]由表2分析可知，阿勒泰羊背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力相关系数为0.8-1.0,表示极强相关;SEC62基因在小鼠背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量相关系数为0.4-0.6,表示中等程度相关，其它品种羊背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力相关系数为〇.〇_〇.2,无明显相关性，说明本发明提供的含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒具有较好的特异性。[0069]实施例四：[0070]采集待测阿勒泰羊个体的血样5ml，提取RNA，并反转录为cDNA;获得引物的序列，进行PCR扩增，其中退火温度为60°C;应用荧光定量PCR技术对其表达量进行检测，在将其表达量与蛋白质和氨基酸含量进行关联分析。对于该基因表达量低的，可淘汰;表达量高的，可留用，以此来选育提高阿勒泰羊的肉品质。[0071]表3:不同阿勒泰羊个体SEC62基因表达量[0072][0073]由表3可知，5号阿勒泰羊的SEC62基因表达量明显高于其他，可留用；其他阿勒泰羊SEC62基因表达量较低，可淘汰，以此来选育提高新疆阿勒泰羊的肉品质。[0074]通过上述实施例提供的适用阿勒泰羊产肉性能选育的SEC62基因试剂盒，可见本发明提供的引物特异性强，扩增效果和重复性好，SEC62基因试剂盒荧光定量PCR检测其扩增曲线和熔解曲线表现良好，此外对新疆阿勒泰羊SEC62基因的表达量进行检测，肌内脂肪含量及脂肪酸含量与羊肉肉质优劣密切关联，SEC62作为影响脂肪代谢的基因，在脂质代谢过程中发挥着重要的作用。本发明的建立，在为选育阿勒泰羊优良品种，提供分子辅助育种的理论基础和技术支持的同时，对于保护阿勒泰羊的优良品种资源、提高农牧民经济收入、加快新疆肉羊业发展具有实际应用价值。[0075]如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

权利要求：1.含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：1特异性引物：SEC62特异性引物：上游引物F:5’-GATAGCAGCCACCCTCTTCC-3’；下游引物R:5’-ACGAGCAACAGCAAGGAGAA-3’；2cDNA模板；3荧光定量PCR反应液和无RNA酶水。2.如权利要求1所述含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的荧光定量PCR反应液为2.5XRealMasterMix。3.如权利要求1所述含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括2.5XRealMasterMixlOyl，上下游引物各0.4μ1，cDNA模板1.5μ1。4.一种如权利要求1所述含SEC62基因用于提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：1cDNA提取:采取阿勒泰羊血样5ml，提取RNA，在-80°C保存;反转录为cDNA，用内参基因ACTB进行PCR扩增；2SEC62基因PCR扩增：特异性扩增SEC62基因的两个片段;反应条件为：94°C预变性5min，94°C变性30s、退火温度30s、72°C延伸lmin，循环31次，72°C延伸5min，4°C保存；3荧光定量PCR检测：在96孔板中分别加入一下荧光定量PCR反应体系：2.5XRealMasterMixSYBRGreen10μ1，上下游引物各0.4μ1，cDNA模板1.5μ1，加水至总体积20μΐ;循环条件为95°C预变性3〇8;95°：变性58;60°：退火3〇8共42个循环;最后在95°：1〇8、65°C5s、94°C5s，作熔解曲线；4基因表达量与蛋白质含量及氨基酸含量的关联分析:对SEC62基因在阿勒泰羊股四头肌中的表达量与必须氨基酸含量进行显著性检验。

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