申请/专利权人：新疆农业大学

申请日：2017-12-28

公开（公告）日：2018-05-04

公开（公告）号：CN107988393A

主分类号：C12Q1/6888(2018.01)I

分类号：C12Q1/6888(2018.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2022.08.19#发明专利申请公布后的驳回;2018.06.01#实质审查的生效;2018.05.04#公开

摘要：本发明公开了含COL1A1基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，根据利用绵羊COL1A1基因的mRNA序列自行人工设计特异性引物，上游引物：5'‑ TACAGCGTCACCTACGACGG‑3'；下游引物：5'‑ AAGCCGAATTCCTGGTCTG‑3'，以样本基因组DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行荧光定量PCR检测，并进行基因表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力的关联分析，表明本发明对阿勒泰羊具有较好的特异性；本发明不仅填补了国内外该研究领域的空白，而且对于保护阿勒泰羊的优良品种资源开发及可持续利用奠定分子理论基础、加快新疆肉羊业发展具有重要意义和实际应用价值。

主权项：一种含COL1A1基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒通过以下共建体系建成获得：（1）设计引物对：利用绵羊COL1A1基因的mRNA序列，自行人工设计特异性引物；（2）PCR反应试剂：Mix、上下游引物、cDNA模板和无RNA酶水。

全文数据：含COL1A1基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒技术领域[0001]本发明涉及动物遗传选育的鉴定方法，具体的，本发明涉及一种阿勒泰羊肉质性状选育的试剂盒的技术领域。背景技术[0002]新疆是我国五大牧区之一，羊肉总产量居全国前列；同时新疆作为少数名族地区，羊肉的需求量呈刚性增长，使得区域内羊肉生产量难以满足人们日益增长的需求量。为解决这一问题，依附于新疆本地丰富和独特的绵羊品种的遗传机制解析显得尤为重要。阿勒泰羊的历史悠久，俗称福海大尾羊，是新疆畜牧业畜种结构中的主要品种，且已取得地理标志，纳入了《中国地理标志产品大典》。主要产区集中在新疆北部的阿勒泰地区福海县、富蕴县、清河县等地，但是随着引种和场间及区间交流，阿勒泰羊现在在全疆基本都有分布。阿勒泰羊属于脂臀羊品种，属于肉脂兼用粗毛羊，具有耐粗饲、抗严寒、抗逆性强、适于放牧，且体质坚实、羔羊生长发育快、肌肉发育良好、产肉脂量高等特点。[0003]阿勒泰羊作为新疆代表性优良品种，具有其独特性，应做好品种资源的有效保护，但由于近年来长期未经选育提高，其优良产肉特性没有得到合理的开发利用，极大地不利于品种资源的合理开发及新疆肉羊产业的发展。目前，运用先进技术手段，结合现代育种技术和传统育种方法，发展新疆优势特色畜牧业，提高绵羊良种化程度，培育肉羊专门化品种，提高羊肉产量和肉质水平，是加快新疆绵羊产业发展的有效手段。[0004]肌内脂肪（Intramuscularfat，IMF，具体指在肌肉内纤维和肌束中的脂肪沉积，和肉的口感及品质呈现正相关，通常，肌内脂肪含量显著影响肉的品质，特别是嫩度及多汁性。肌内脂肪含量的增加，显著影响大理石纹的评分P〈〇.05。一般，脂肪组织会分布在肌肉的肌束膜上，使结缔组织纤维距离变远，通过热处理，脂肪细胞被破坏，品尝时会产生比较滑嫩、新鲜、多汁的口感。[0005]COLlAl基因（CollagentypeIalpha1，C0L1A1定位于绵羊11号染色体，其编码的是⑶Ll的αΐ链，I型胶原蛋白是构成细胞外基质ExtracellularMatrix，ECM的主要组成成分，为机体器官形态提供支撑、在细胞发育和细胞之间相互作用上发挥重要作用。在其他动物上针对该基因也有部分研究，COLlAl基因对猪的红细胞分布宽度及屠宰率DP%存在一定的调控作用，对牛的坐骨端宽有一定的调控作用，在对肉牛不同大理石花纹等级分子机制的研究中发现，背最长肌大理石花纹评级为1级和大理石花纹评级为6级的两组间COLlAl基因存在差异表达，说明COLlAl基因是参与调控秦川牛阉割前后肉质性状差异的重要调控基因。在绵羊上的研究主要是针对疾病防治过程的研究，尚无该基因对阿勒泰羊肉质影响的研究，以及对于阿勒泰羊特殊新疆典型性品种肉质改良的特殊性研究。现有技术未在国内外未见到利用COLlAl基因对阿勒泰羊肉质性状进行选育提高的研究和报道。发明内容[0006]针对现有技术中未见报道专门针对COLlAl基因在阿勒泰羊肉质性状选育中的分子标记研究及阿勒泰羊品种的特殊性的技术现状，本发明旨在为了提供含COLlAl基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，用于选育提高阿勒泰羊的肉质性能。[0007]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：[0008]本发明提供含COLlAl基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，试剂盒通过以下共建体系建成获得：[0009]1设计引物对:利用绵羊COLlAl基因的mRNA序列，自行人工设计特异性引物。[0010]⑵PCR反应试剂:Mix、上下游引物、cDNA模板和无RNA酶水。[0011]优选的，共建体系⑴中所述的特异性引物如下所示：[0012]COLlAl引物：[0013]上游引物F:5’-TACAGCGTCACCTACGACGG-3’；[0014]下游引物1?:5’-厶厶601^厶11'0^661'^6-3’。[0015]进一步，本发明提供含COLlAl基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒的应用，包括以下步骤：[0016]1阿勒泰羊背最长肌RNA提取:采取阿勒泰羊背最长肌30-50mg，提取RNA，在-80°C保存；反转录为cDNA，用内参基因ACTB进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察条带的大小和亮度，判断cDNA的提取及转录质量。[0017]2⑶LlAl基因PCR扩增:根据共建体系中设计的两对引物，特异性扩增⑶LlAl基因的两个片段;PCR反应体系为:Mix10.Ομί，上下游引物各0.4μ1，cDNA模板1.5μ1，加无RNA酶水至总体积20μ1;反应条件为：94°C预变性5min，94°C变性30s、退火温度30s、72°C延伸Imin，循环35次，72°C延伸5min，4°C保存;特异性扩增的两个PCR产物均由1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察扩增带的大小和亮度，判断PCR产物扩增质量。[0018]3荧光定量PCR检测：在96孔板中分别加入一下荧光定量PCR反应体系：2.5XRealMasterMixSYBRGreen10μ1，上下游引物各0.4μ1，cDNA模板1.5μ1，加无RNA酶水至总体积20μ1;整个反应在BIO-RAD荧光定量PCR序列扩增仪中进行，循环条件为95°C预变性30s;95°C变性5s;60°C退火30s共40个循环;最后在95°CIOs、65°C5s、94°C5s，作熔解曲线。[0019]⑷基因表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力的关联分析:得出COLlAl基因在阿勒泰羊背最长肌中的表达量与肌内脂肪酸含量、背最长肌剪切力呈显著正相关P〇.05与水分含量呈显著负相关P0.05，表明COLlAl基因对阿勒泰羊肉的肉品质起到一定调控作用。说明该基因影响阿勒泰羊肌肉营养物质代谢，可作为影响决定阿勒泰羊肉质性状的分子标记。[0020]本发明中，应用的荧光定量PCR技术为本领域公知技术手段，为本领域普通技术人员采用的常见技术手段。[0021]本发明中，阿勒泰羊⑶LlAl基因特异性引物设计中，通过国际分子生物信息网站NCBINationalCenterforBiotechnology，检索得到绵羊COLlAl基因和cDNA序列，借助公知软件Primer5.0，自行人工设计特异性引物，引物序列自行进行合成。[0022]通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果：[0023]1本发明中，在构建一种用于选育阿勒泰羊肉质性状的试剂盒中，在采用现有技术中COLlAl基因作为影响家畜生产性能候选基因并构建试剂盒，对于适用绵羊，特别是适用阿勒泰羊肉质性状进行选育提高方面的技术未见报道，由于阿勒泰羊种地处常年低温，冬季长达近半年，且最冷可达-35°C至_40°C，由于自然条件恶劣，许多优良品种在这里无法生存；可见阿勒泰羊是在极其恶劣的生境条件下，通过长期的自然和人工选择而形成的独特的种质资源。基于此，将本发明提供的含COLlAl基因检测试剂盒应用于猪、八音布鲁克羊、塔什库尔干羊、巴什拜羊、新疆细毛羊、柯尔克孜羊、和田羊中，分析⑶LlAl基因表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力的关联度，结果表明仅有阿勒泰羊COLlAl基因表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力的关联度处于0.8-1.0之间表现为极强相关性，其余动物COLlAl基因表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力的关联度处于〇.〇_〇.2之间表现为无相关性。故本发明提供的含COLlAl基因检测试剂盒对于阿勒泰羊具有较好的特异性，这对于选育提高阿勒泰羊肉质性能及合理优化种质资源具有重大而深远的技术贡献和现实作用。[0024]2本发明通过具体提供含COLlAl基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，利用基因试剂盒对新疆阿勒泰羊COLlAl基因的表达量进行检测，并与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力的关联分析，得出COLlAl基因在阿勒泰羊背最长肌中的表达量与肌内脂肪酸含量、背最长肌剪切力呈显著正相关（P〇.05与水分含量呈显著负相关（P0.05，表明COLlAl基因对阿勒泰羊肉的肉品质起到调控作用。说明该基因影响阿勒泰羊肌肉营养物质代谢，可作为影响决定阿勒泰羊肉质性状的分子标记，据此可用本发明提供含COLlAl基因检测试剂盒提高阿勒泰羊的肉质性能。这不仅填补了国内外这一研究领域的空白，而且对于保护阿勒泰羊的优良品种资源开发及可持续利用奠定分子理论基础、加快新疆肉羊业发展具有重要意义和实际应用价值。附图说明[0025]图1为总RNA产物电泳图。[0026]图2为PCR扩增产物电泳图，图中，M为DL2000DNAMarker，泳道1-10为PCR扩增产物。具体实施方式[0027]下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中的设备和材料有：[0028]采用的主要原材料及相关试剂等:TrizolTotalRNAReagent总RNA提取试剂由北京天根公司提供；VACUETTE®Z:SerumClotActivator真空采血血清管由奥地利GreinerBio-One公司提供；2XTaqPCRMasterMix由博迈德生物（PC0912提供；DL2000DNAMarker由庄盟生物（ZM404-1提供；EB由新疆宝信提供；2.5XRealMasterMixSYBRGreen由日本Takara公司提供。[0029]主要仪器设备:TG16-W微量高速离心机产自长沙湘仪离心机仪器有限公司；DYCZ-24F型电泳槽和DYY-6C型电泳仪产自北京市六一仪器厂;AL204-IC电子天平产自梅特勒-托勒多仪器厂上海有限公司;JY04S凝胶成像仪产自北京君意东方电泳设备有限公司；恒温箱恒温水浴振荡器产自北京桑翌实验仪器研究所;CFX-96荧光定量PCR仪产自美国Bio-Rad公司。[0030]本发明中选用的所有原辅材料、试剂和仪器、设备都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。[0031]实施例一：[0032]含COLlAl基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，试剂盒具体通过以下共建体系建成获得：[0033]1设计引物对:利用绵羊⑶LlAl基因的mRNA序列，自行人工设计特异性引物，弓丨物如下所示：[0034]COLlAl引物：[0035]上游引物F:5，-TACAGCGTCACCTACGACGG-3，；[0036]下游引物R:5，-AAGCCGAATTCCTGGTCTG-3，。[0037]⑵PCR反应试剂:Mix、上下游引物、cDNA模板和无RNA酶水。[0038]实施例二：[0039]本发明提供含COLlAl基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒的应用，包括以下步骤：[0040]1基因组RNA提取：[0041]采集待测阿勒泰羊背最长肌30-50mg，液氮保存;提取RNA，在-80°C保存;反转录为cDNA，用内参基因ACTB进行PCR扩增。[0042]配制1.5%琼脂糖凝胶:琼脂糖1.5g，溶于100ml0.5XTBE，微波炉加热至充分溶解，待降至室温后倒入插有梳子的胶槽内，冷却凝固后待用。[0043]利用配制的1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压100V，电流50mA，电泳35分钟。经溴化已锭染色15分钟后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察条带的大小和亮度，判断cDNA的提取质量。结果参见附图1。[0044]⑵PCR扩增：[0045]PCR扩增反应体系及程序优化。根据上述共建体系中设计的两对引物，特异性扩增COLlAl基因的两个片段。PCR反应体系为:MixlO.Ομί，上下游引物各0.4μ1，DNA模板1.5μ1，加无RNA酶水至总体积20μ1;反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s、退火温度30s、72。:延伸lmin，循环35次，72°C延伸5min，4°C保存。[0046]对引物的PCR扩增反应程序的退火温度进行优化。在其他反应条件不变的情况下，在PCR仪上对退火温度设置梯度，梯度范围为55°C-65°C，即平均每个板孔变化温度为1°C。经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察扩增条带的亮度和纯度，最终确定引物的最适退火温度为60。。。[0047]特异性扩增的两组PCR产物均由1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电压100V，电泳35min，经溴化已锭EB染色15min后，于Bio-RAD凝胶成像仪紫外灯下照射，观察扩增条带的大小和亮度，判断PCR产物扩增质量。结果参见附图2。[0048]3荧光定量PCR检测：[0049]在96孔板中分别加入一下荧光定量PCR反应体系：2.5XRealMasterMixSYBRGreen10μ1，上下游引物各0.4μ1，cDNA模板1.5μ1，加水至总体积20μ1;整个反应在BIO-RAD荧光定量PCR序列扩增仪中进行，循环条件为95°C预变性30s;95°C变性5s;60°C退火30s共40个循环;最后在95°CIOs、65°C5s、94°C5s，作熔解曲线。为保证特异性的扩增，要求得到的溶解曲线只有一个峰。[0050]⑷关联分析：[0051]利用软件SPSS21.0,将基因的表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力的关联分析检验，结果如下表1:[0052]表1:阿勒泰羊COLlAl基因的表达量与部分肉品质指标的关联分析[0054]注表示显著相关P〈0.05表示极显著相关P〈0.01。[0055]从表1可以看出，在新疆阿勒泰羊群体中，COLlAl基因的表达量与阿勒泰羊肌肉中肌内脂肪酸含量、背最长肌剪切力呈显著的正相关P〈〇.05，与水分含量呈显著的负相关P〈0.01。以此表明，COLlAl基因可作为新疆阿勒泰羊影响肉质的一个分子标记，采用本发明提供的含COLlAl基因检测试剂盒可用于选育提高阿勒泰羊的肉质性能。[0056]实施例三：[0057]基于实施例^，米用上述实施例提供的含COLlAl基因提尚阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒分别应用于猪、八音布鲁克羊、塔什库尔干羊、巴什拜羊、新疆细毛羊、柯尔克孜羊、和田羊中，观测COLlAl基因在其背最长肌中的表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力的关联度。具体见表2:[0058]表2:COLlAl基因表达量与部分肉品质指标的关联分析[0060]注:0.8-1.0极强相关;0.0-0.2无相关。[0061]据表2分析得除阿勒泰羊外，COLlAl基因在其它动物背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力无明显相关性，说明本发明提供的含COLlAl基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒具有较好的特异性。[0062]实施例四：[0063]采集待测阿勒泰羊个体1号至10号的背最长肌30-50mg，提取RNA，并反转录为cDNA;获得引物序列，进行PCR扩增，其中退火温度为60°C;应用荧光定量PCR技术对其表达量进行检测，在将其表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力的关联分析对于该基因表达量低的，可淘汰;表达量高的，可留用，以此来选育提高新疆阿勒泰羊的肉品质。[0064]表3:阿勒泰羊个体COLlAl基因表达量与部分肉品质指标的关联分析[0066]据表3可知，8号阿勒泰羊个体COLlAl基因表达量与部分肉品质指标的关联度最大，表明COLlAl基因在8号阿勒泰羊个体中的表达效果最好，采用本发明提供的含COLlAl基因检测试剂盒可留用来选育提高新疆阿勒泰羊的肉品质具有并获得显著良好技术效果。[0067]针对现有技术中未见报道专门针对COLlAl基因在阿勒泰羊肉质性状选育中的分子标记研究的技术现状，本发明旨在为了提供含COLlAl基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，利用基因试剂盒对新疆阿勒泰羊的COLlAl基因表达量进行检测，并与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力进行关联分析，分析得COLlAl基因的表达量与阿勒泰羊肌肉中肌内脂肪酸含量、背最长肌剪切力呈显著的正相关P〈〇.05，与水分含量呈显著的负相关P〈〇.01。通过试验表明采用本发明提供的含COLlAl基因检测试剂盒可用于选育提高阿勒泰羊的肉质性能并获得显著突出技术效果。这不仅填补了国内外这一研究领域的空白，而且对于保护阿勒泰羊优良品种资源的合理开发及可持续利用、加快新疆肉羊业发展具有重要意义和实际应用价值。[0068]如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

权利要求：1.一种含COLlAl基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒通过以下共建体系建成获得：1设计引物对:利用绵羊COLlAl基因的mRNA序列，自行人工设计特异性引物；2PCR反应试剂:Mix、上下游引物、cDNA模板和无RNA酶水。2.如权利要求1所述的含COLlAl基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒，其特征在于，所述的特异性引物序列如下所示：上游引物F:5’-TACAGCGTCACCTACGACGG-3’；下游引物R:5’_AAGCCGAATTCCTGGTCTG-3’。3.—种如权利要求1所述含COLlAl基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：阿勒泰羊背最长肌RNA提取:采取阿勒泰羊背最长肌30-50mg，提取RNA，在-80°C保存；反转录为cDNA，用内参基因ACTB进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察条带的大小和亮度，判断cDNA的提取及转录质量；2⑶LlAl基因PCR扩增：根据设计的两对引物，特异性PCR扩增⑶LlAl基因的两个片段，特异性扩增的两个PCR产物均由1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察扩增带的大小和亮度，判断PCR产物扩增质量；3荧光定量PCR检测：在96孔板中分别加入一下荧光定量PCR反应体系：2.5XRealMasterMixSYBRGreen10μΐ，上下游引物各0.4μΐ，cDNA模板1.5μΐ，加无RNA酶水至总体积20μΐ;整个反应在BIO-RAD荧光定量PCR序列扩增仪中进行，循环条件为95°C预变性30s;95°C变性5s;60°C退火30s共40个循环；最后在95°：1〇8、651€58、941€58，作熔解曲线；4基因表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及剪切力的关联分析。4.如权利要求3所述含COLlAl基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒的应用，其特征在于，所述的PCR扩增的反应体系为：Mix10.0μΐ，上下游引物各0.4yl，cDNA模板1.5μΐ，加无RNA酶水至总体积20μΐ。5.如权利要求3所述含COLlAl基因提高阿勒泰羊肉质性状的检测试剂盒的应用，其特征在于，所述的PCR扩增的反应条件如下：94°C预变性5min，94°C变性30s、退火温度3〇8、72°：延伸1111丨11，循环35次，72°：延伸5min，4°C保存。

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