申请/专利权人：新疆农业大学

申请日：2017-12-28

公开（公告）日：2018-05-04

公开（公告）号：CN107988392A

主分类号：C12Q1/6888(2018.01)I

分类号：C12Q1/6888(2018.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2022.09.02#发明专利申请公布后的驳回;2018.06.01#实质审查的生效;2018.05.04#公开

摘要：本发明公开了含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒，本发明根据利用绵羊SEC61A1基因的mRNA序列自行人工设计特异性引物，正向引物：5'‑ TATGTGATGACGGGAATGT‑3'；反向引物：5'‑ GGTCTCGCAGATGTTAGTG ‑3'，以样本基因组DNA为模板进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行荧光定量PCR检测，并进行基因表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及肉重的关联分析；本发明不仅填补了国内外这一研究领域的空白，而且对于保护阿勒泰羊优良品种资源、促进品种资源的合理开发奠定基础，同时对加快新疆肉羊业发展与提升高品质羊肉生产水平具有重要意义和实际应用价值。

主权项：含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒通过以下共建体系建成获得：（1）设计引物对：利用绵羊SEC61A1基因的mRNA序列，自行人工设计特异性引物；（2）PCR反应试剂：Mix、上下游引物、cDNA模板和无RNA酶水。

全文数据：含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒技术领域[0001]本发明涉及动物遗传选育的鉴定方法，具体的，本发明涉及一种阿勒泰羊产肉性能选育的试剂盒的技术领域。背景技术[0002]阿勒泰羊，为新疆地方优秀肉羊品种，是古老的哈萨克绵羊品种中的一个分支品系，早在公元前后为哈萨克的祖先乌孙人所饲养。羔羊具有突出的早熟特征，适于羊肉生产，属肉、脂兼用品种。阿勒泰羊的主要产区集中在新疆北部的阿勒泰地区福海县、富蕴县、清河县等地，分布在阿勒泰、布尔津、吉木乃及哈巴河等县，但是随着引种和场间及区间交流，阿勒泰现在在全疆基本都有分布。阿勒泰羊体格大，体质结实。胸宽深，背平直，肌肉发育良好。四肢高而结实，股部肌肉丰满。其突出性状主要体现在产肉性状上，并且阿勒泰羊体格大、肉脂生产性能高，具有耐粗饲、善跋涉、抗严寒、体质坚实、适宜放牧等特点。阿勒泰羊属大型的肉羊品种，与国内各牧区的羊种比较，也略胜一筹。新疆区内的地方良种巴什拜羊、巴音布鲁克羊及区外良种的蒙古羊，包括其亚型如滩羊、寒羊、同羊、湖羊等，平均活重都低于阿勒泰羊。阿勒泰羊已经作为我区畜牧业畜种结构中的主要品种。阿勒泰羊种地处常年低温，冬季长达近半年，且最冷可达-35至-40°c，由于自然条件恶劣，许多优良品种在这里无法生存，而阿勒泰羊就是在这样一个特殊的条件下，通过长期的自然和人工选择而形成的，如何选育提高阿勒泰羊产肉性能，是加快提高恢复阿勒泰羊优良产肉性能的关键，这实际上是本领域目前普遍存在的共性问题，如何解决迫在眉睫。[0003]肉中蛋白质含量仅次于水分含量，是肉的重要组成部分，也是人类膳食中不可缺少的营养组分。在肉品的蛋白质中，氨基酸的种类和含量比例是决定蛋白质营养价值的主要因素，氨基酸与肉质关系主要在于所含人体必需氨基酸和酸性氨基酸的水平。肉品中的苏氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸为成年人必需氨基酸，婴儿必需氨基酸还包括精氨酸和组氨酸。另外，天冬氨酸和谷氨酸这两种酸性氨基酸与肉品的风味特别是鲜味有关，被称为鲜味氨基酸。肌肉营养价值与其蛋白质、脂肪含量有关。蛋白质在肉中组织蛋白酶及其他因素的作用下逐渐降解成多肽、小肽、游离氨基挥发性羰基化合物、肉品中氨基酸的组成情况，决定肌肉蛋白质的品质，并与肉质和风味相关。有研究报道，氨基酸中的丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、丙氨脯氨酸是肉香味的必需前体氨基酸，尤其谷氨酸和天门冬氨酸是肉中的主要鲜味物质，被称为鲜味氨基酸，这两种氨基酸与肉的风味有直接的关系，是通过对羊肉氨基酸等营养成分的分析和评价，可从食品营养学角度为人们科学食用肉类提供理论指导。有些特殊的氨基酸如，芳香族氨基酸包括苯丙氛酸PHE、色氨酸TRP、酪氨酸TYR，它们在机体生命活动中起着极为重要的作用。在肉品的蛋白质中，氨基酸的种类和含量比例是蛋白质营养价值的主要评价指标，氨基酸与肉质的关系主要在于所含人体必需氨基酸和酸性氨基酸的水平。酸性氨基酸，尤其是谷氨酸具有形成肉鲜味以及缓冲咸、酸等不良味道的特殊作用，所以被称为是鲜味氨基酸。[0004]SEC61A1基因，是编码Sec61a亚基的基因，位于绵羊的19号染色体上。Sec61亚单位α同种型ISEC61a是哺乳动物内质网的一部分。SEC61A1基因部分单核苷酸的突变可以导致部分氨基酸残基的灵活性的增加，从而使通道的孔结构和改变通透性不稳定，影响易位或诱导异常的信号肽取向。目前针对该基因的研究主要集中在人类的糖尿病及肾小管间质性肾炎等疾病，未见与阿勒泰羊肉品质相关的报道。发明内容[0005]针对现有技术中未见报道专门针对SEC61A1基因在阿勒泰羊产肉性能选育中的分子标记研究的技术现状，本发明旨在为了提供了含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒，用于选育提高阿勒泰羊产肉性能。[0006]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：[0007]本发明提供含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒，试剂盒通过以下共建体系建成获得：[0008]1设计引物对:利用绵羊SEC61A1基因的mRNA序列OienBank登录号：SEC61A1:XM_015102503.1，自行人工设计特异性引物。[0009]⑵PCR反应试剂:Mix、上下游引物、CDNA模板和无RNA酶水。[0010]优选的，共建体系⑴中所述的特异性引物如下所示：[0011]SEC61A1引物：[0012][0013][0014]进一步，本发明提供含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒的应用，包括以下步骤：[0015]1阿勒泰羊背最长肌RNA提取:采取阿勒泰羊羊背最长肌30-50mg，提取RNA，在-80°C保存;反转录为cDNA，用内参基因ACTB进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察条带的大小和亮度，判断cDNA的提取及转录质量。[0016]2SEC6IA1基因PCR扩增:根据设计的两对引物，特异性扩增SEC61A1基因的两个片段;PCR反应体系为:Mix10.Ομί，上下游引物各0.4μ1，cDNA模板1.5μ1，加无RNA酶水至总体积20μ1;反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s、退火温度30s、72°C延伸Imin，循环35次，72°C延伸5min，4°C保存;特异性扩增的两个PCR产物均由1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察扩增带的大小和亮度，判断PCR产物扩增质量。[0017]3荧光定量PCR检测：在96孔板中分别加入一下荧光定量PCR反应体系：2.5XRealMasterMixSYBRGreen10μ1，上下游引物各0.4μ1，cDNA模板1.5μ1，加无RNA酶水至总体积20μ1;整个反应在BIO-RAD荧光定量PCR序列扩增仪中进行，循环条件为95°C预变性308;95°：变性58;60°：退火308共40个循环；最后在95°：108、651€58、941€58，作熔解曲线，为保证特异性的扩增，要求得到的熔解曲线只有一个峰。[0018]4基因表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及肉重的关联分析:得出SEC61A1基因在阿勒泰羊背最长肌中的表达量与肌内脂肪酸含量呈显著正相关P〇.05与水分含量呈显著负相关P〇.〇5，表明SEC61A1基因对阿勒泰羊肉的肉品质起到调控作用。以此说明本发明采用SEC61A1基因影响阿勒泰羊肌肉营养物质代谢，可作为影响决定阿勒泰羊肉质及产肉性能的分子标记。[0019]本发明中，应用的荧光定量PCR技术为本领域公知技术手段，为本领域普通技术人员采用的常见技术手段。[0020]本发明中，阿勒泰羊SEC61A1基因特异性引物设计中，通过国际分子生物信息网站NCBINationalCenterforBiotechnology，检索得到绵羊SEC61A1基因和的cDNA序列GenBank登录号：SEC61A1:XM_015098715.1，可采取借助公知软件Primer5.0，自行人工设计特异性引物，引物序列自行进行合成。[0021]通过采用上述提供的技术方案，本发明获得以下有益效果：[0022]1本发明在构建一种含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒，通过应用，阿勒泰羊背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力相关系数为0.8-1.0,极强相关;其它品种羊背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力相关系数为〇.〇_〇.2,无明显相关性，说明此试剂盒具有较好的特异性；SEC61A1基因对适用阿勒泰羊类肉性状进行选育提高方面的技术未见报道，由于阿勒泰羊种地处常年低温，冬季长达近半年，且最冷可达-35°C至-40°C，由于自然条件恶劣，许多优良品种在这里无法生存，而阿勒泰羊就是在这样一个特殊的条件下，通过长期的自然和人工选择而形成的，可见，本发明提供的用于选育阿勒泰羊产肉性能的分子标记方法，对于选育提高阿勒泰羊产肉性能具有重大而深远的技术贡献和现实作用。[0023]2本发明通过具体提供含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒，利用基因试剂盒对新疆阿勒泰羊SEC61A1基因的表达量进行检测，在新疆阿勒泰羊群体中，采用SEC61A1基因在阿勒泰羊臂三头肌的表达量与天门冬氨酸含量呈极显著正相关，P〈0.01;和谷氨酸含量呈显著正相关，P〈〇.05,表明该基因影响阿勒泰羊肉风味物质物质的积累，可作为影响决定阿勒泰羊肉品质的分子标记，用以提高阿勒泰羊的肉质性能，这不仅填补了国内外这一研究领域的空白，而且对于保护阿勒泰羊优良品种资源、促进品种资源的合理开发与可持续利用奠定基础，同时对加快新疆肉羊业发展与提升高品质羊肉生产水平具有重要意义和实际应用价值。附图说明[0024]图1为总RNA产物电泳图。[0025]图2为PCR扩增产物电泳图，图中，M为DL2000DNAMarker，泳道1-10为PCR扩增产物。[0026]图3为SEC61A1基因的熔解曲线图。[0027]图4为SEC61A1基因的表达量比较图。具体实施方式[0028]本发明中选用的所有试剂、原料和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。[0029]实施例一：[0030]含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒，试剂盒通过以下共建体系建成获得：[0031]1设计引物对:利用绵羊SEC61Al基因的mRNA序列OienBank登录号：SEC61Al:XM_015102503.1，自行人工设计特异性引物，引物如下所示：[0032]SEC61A1引物：[0033]上游引物F:5，-TATGTGATGACGGGAATGT-3，；[0034]下游引物R:5，-GGTCTCGCAGATGTTAGTG-3，。[0035]⑵PCR反应试剂:Mix、上下游引物、cDNA模板和无RNA酶水。[0036]实施例二：[0037]含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒的应用，包括以下步骤：[0038]1基因组RNA提取：[0039]采集待测阿勒泰羊背最长肌、臂三头肌、股四头肌各30-50mg，液氮保存;提取RNA，在-80°C保存;反转录为cDNA，用内参基因ACTB进行PCR扩增。[0040]配制1.5%琼脂糖凝胶:琼脂糖1.5g，溶于100ml0.5XTBE，微波炉加热至充分熔解，待降至室温后倒入插有梳子的胶槽内，冷却凝固后待用。[0041]利用配制的1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电压100V，电流50mA，电泳35分钟;经溴化已锭染色15分钟后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察条带的大小和亮度，判断cDNA的提取质量，参见附图1所示。[0042]⑵PCR扩增：[0043]PCR扩增反应体系及程序优化：[0044]根据设计的两对引物，特异性扩增SEC61A1基因的两个片段，扩增片段大小为180bp，碱基参见附后提供的基因序列表。PCR反应体系为:Mix10.Ομί，上下游引物各0.4μI，DNA模板1.5μ1，加无RNA酶水至总体积20μ1;反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性30s、退火温度30s、72°C延伸lmin，循环35次，72°C延伸5min，4°C保存。[0045]对引物的PCR扩增反应程序的退火温度进行优化。在其他反应条件不变的情况下，在PCR仪上对退火温度设置梯度，梯度范围为55°C-65°C，即平均每个板孔变化温度为1°C。经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，观察扩增条带的亮度和纯度，最终确定引物的最适退火温度为60。。。[0046]特异性扩增的两组PCR产物均由1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电压100V，电泳35min，经溴化已锭EB染色15min后，于Bio-RAD凝胶成像仪紫外灯下照射，观察扩增条带的大小和亮度，判断PCR产物扩增质量，结果参见附图2。[0047]3荧光定量PCR检测：[0048]在96孔板中分别加入一下荧光定量PCR反应体系：2.5XRealMasterMixSYBRGreen10μ1，上下游引物各0.4μ1，cDNA模板1.5μ1，加水至总体积20μ1;整个反应在BIO-RAD荧光定量PCR序列扩增仪中进行，循环条件为95°C预变性30s;95°C变性5s;60°C退火30s共40个循环;最后在95°CIOs、65°C5s、94°C5s，作熔解曲线，如附图3;为保证特异性的扩增，要求得到的熔解曲线只有一个峰。[0049]⑷关联分析：[0050]利用软件SPSS21.0，将基因的表达量与蛋白质和氨基酸含量进行关联分析检验，结果表1和附图4:[0051]表I:阿勒泰羊不同部位SEC61Al基因的表达量与肉品质指标的关联分析[0053]注表示显著相关P〈0.05表示极显著相关P〈0.01。[0054]从表1可以看出，在新疆阿勒泰羊群体中，采用SEC61A1基因在阿勒泰羊臂三头肌的表达量与天门冬氨酸含量呈极显著正相关（P〈〇.01和谷氨酸含量呈显著正相关（P〈0.05，表明采用本发明含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒对阿勒泰羊肉的肉品质起到明显调控作用。说明该SEC61A1基因影响阿勒泰羊肉风味物质物质的积累，可作为影响决定阿勒泰羊肉品质的分子标记。[0055]实施例三：[0056]基于实施例二，采用上述实施例提供的含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒分别应用于小鼠、小尾寒羊、卡拉库尔羊、和田羊、哈萨克羊、巴音布鲁克羊中，观测SEC61A1基因在其背最长肌中的表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力的关联度。具体见表2:[0057]表2:SEC61A1基因表达量与部分肉品质指标的相关系数[0059]~注:0.0-0.2无相关，0.4-0.6中等程度相关，0.8-1.0极强相关。[0060]由表2分析可知，阿勒泰羊背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力相关系数为0.8-1.0,表示极强相关;其它品种羊背最长肌中表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及背最长肌剪切力相关系数为〇.〇_〇.2,无明显相关性，说明本发明提供的含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒具有较好的特异性。[0061]实施例四：[0062]采集待测阿勒泰羊个体的背最长肌、臂三头肌、股四头肌30-50mg，提取RNA，并反转录为cDNA;获得引物序列，进行PCR扩增，其中退火温度为60°C，应用荧光定量PCR技术对其表达量进彳丁检测;对于该基因表达量低的，可淘汰;表达量尚的，可留用，以此来选育提尚新疆阿勒泰羊的肉品质。[0063]表3:不同阿勒泰羊个体SEC61A1基因表达量[0064][0065]由表3可知，3号阿勒泰羊的PRKAAl基因表达量明显高于其他，可留用；其他阿勒泰羊PRKAAl基因表达量较低，可淘汰，以此来选育提高新疆阿勒泰羊的肉品质。[0066]针对现有技术中未见报道专门针对SEC61A1基因在阿勒泰羊羊产肉性能选育中的分子标记研究的技术现状，本发明旨在为了提供了含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒，利用基因试剂盒对新疆阿勒泰羊SEC61A1基因的表达量进行检测，并与蛋白质含量、风味氨基酸含量进行关联分析，从而找出与阿勒泰羊肉质显著相关的分子标记，用以提高阿勒泰羊的肉质性能，这不仅填补了国内外这一研究领域的空白，而且对于保护阿勒泰羊优良品种资源、促进品种资源的合理开发与可持续利用奠定基础，同时对加快新疆肉羊业发展与提升高品质羊肉生产水平具有重要意义和实际应用价值。[0067]如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

权利要求：1.含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒通过以下共建体系建成获得：1设计引物对:利用绵羊SEC61A1基因的mRNA序列，自行人工设计特异性引物；2PCR反应试剂:Mix、上下游引物、cDNA模板和无RNA酶水。2.如权利要求1所述含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒，其特征在于，所述的特异性引物序列如下所示：上游引物F:5’-TATGTGATGACGGGAATGT-3’；下游引物R:5’_GGTCTCGCAGATGTTAGTG-3’。3.—种如权利要求1所述含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒的应用，其特征在于，包括以下步骤：1阿勒泰羊背最长肌RNA提取:采取阿勒泰羊羊背最长肌30-50mg，提取RNA，在-80°C保存;反转录为cDNA，用内参基因ACTB进行PCR扩增，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察条带的大小和亮度，判断cDNA的提取及转录质量；2SEC61A1基因PCR扩增:根据设计的两对引物，特异性PCR扩增SEC61A1基因的两个片段，特异性扩增的两个PCR产物均由1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，经溴化已锭染色后，于凝胶成像仪紫外灯下照射，观察扩增带的大小和亮度，判断PCR产物扩增质量；3荧光定量PCR检测：在96孔板中分别加入以下荧光定量PCR反应体系：2.5XRealMasterMixSYBRGreen10μΐ，上下游引物各0.4μΐ，cDNA模板1.5μΐ，加无RNA酶水至总体积20μΐ;整个反应在BIO-RAD荧光定量PCR序列扩增仪中进行，循环条件为95°C预变性30s;95°C变性5s;60°C退火30s共40个循环；最后在95°：1〇8、651€58、941€58，作熔解曲线；4基因表达量与肌内脂肪酸含量、水分含量及肉重的关联分析。4.如权利要求3所述含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒的应用，其特征在于，所述的PCR扩增的反应体系为：Mix10.0μΐ，上下游引物各0.4yl，cDNA模板1.5μΐ，加无RNA酶水至总体积20μΐ。5.如权利要求3所述含SEC61A1基因用于提高阿勒泰羊产肉性能的试剂盒的应用，其特征在于，所述的PCR扩增的反应程序如下：94°C预变性5min，94°C变性30s、退火温度3〇8、72°：延伸1111丨11，循环35次，72°：延伸5min，4°C保存。

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