申请/专利权人：西布列塔尼大学;法国国家健康与医学研究院;布雷斯特大学医疗中心

申请日：2015-07-31

公开（公告）日：2019-03-29

公开（公告）号：CN106716130B

主分类号：G01N33/564(2006.01)I

分类号：G01N33/564(2006.01)I;G01N33/574(2006.01)I;A61K39/395(2006.01)I;A61P35/02(2006.01)I;A61P37/02(2006.01)I

优先权：["2014.08.06 EP 14290232.9"]

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2023.08.11#未缴年费专利权终止;2019.03.29#授权;2017.06.16#实质审查的生效;2017.05.24#公开

摘要：本发明涉及位于细胞的质膜的STIM1蛋白的部分在以下方法中的用途，该方法用于筛选用于治疗慢性淋巴细胞白血病和或系统性红斑狼疮的候选分子。本发明还涉及与位于细胞的质膜的STIM1蛋白的部分相互作用的物质，用于在治疗慢性淋巴细胞白血病和或系统性红斑狼疮中作为药用产品使用，以及涉及包含至少一种根据本发明的物质的药物组合物。

主权项：1.位于细胞的质膜的STIM1蛋白的分离部分在一种方法中的用途，所述方法用于体外筛选用于治疗慢性淋巴细胞白血病和或系统性红斑狼疮的候选分子，其中，所述细胞是分离的整个细胞。

全文数据：使用膜STIM1筛选化合物的方法技术领域本发明涉及STIM1基质相互作用分子1或GOK蛋白的膜部分在筛选的方法中的用途，以及涉及与位于质膜的STIM1蛋白的部分相互作用的物质用于治疗用途，和包含至少这种物质的药物组合物。在下面给出的描述中，在方括号[]中的参考文献是指在文本的结尾处给出的参考文献。背景技术系统性红斑狼疮SLE和慢性淋巴细胞白血病CLL仍然无法治愈。SLE是自身免疫性起源的异质性疾病，特征在于存在自身反应性淋巴细胞以及存在抗核自身抗体ANA。它是具有非常不同的临床表现的多系统疾病。患病率在不同的族群中是不同的，但估计为约110000，其中男女比例为10:1。这种疾病的临床异质性反映了它的致病复杂性，这包括遗传和环境因素。SLE可能影响所有器官。最常见的表现是皮疹、关节炎和疲劳。最严重的表现包括肾炎、神经病症、贫血和血小板减少。90％以上的患者具有ANA，其被认为是高于1160阳性的。SLE是具有发作性进展的疾病。目前治疗的目的是：治疗急性发作，其可能会影响重要的预后，最小化在相对稳定的时期爆发的风险，以及监测症状，这些症状虽然不危害重要的预后，但影响日常生活质量。羟氯喹和非甾体类抗炎药适用于SLE的温和形式；皮质激素类和免疫抑制剂被保留用于最严重的形式；靶向B淋巴细胞B细胞的抗CD20单克隆抗体利妥昔单抗rituximab，目前适用于受到更严重影响并且对通常治疗没有响应的患者[1]。尽管在引入皮质激素类和免疫抑制剂以后预后改善，但SLE继续对患者发病率和死亡率有显著的影响。CLL是慢性恶性血液病，其还影响B细胞。这些细胞在免疫系统水平上发挥重要作用。在CLL过程中，在它们的生命周期中当CLL的B细胞达到成熟时，它们被阻断，然而它们继续产生。因此，这些B细胞最终积累在血液、神经节、脾、肝和骨髓中，这导致次级淋巴器官的容积的增加。目前可用的针对CLL的治疗是当疾病处于晚期阶段时最常用的。在CLL的强化治疗中使用的化疗产品是单独使用的苯丁酸氮芥、单独使用的氟达拉滨、CHOP型的每月化疗四种药剂的组合：环磷酰胺-H阿霉素adryamycin-硫酸长春新碱长春新碱-泼尼松。就靶向治疗而言，因为白血病B细胞是CD20+，特异性地识别此靶点的单克隆抗体可以用于治疗利妥昔单抗，。另一个靶点是对于B细胞具有特异性的Bruton的酪氨酸激酶，其在白血病细胞中的表达增加。依鲁替尼Ibrutinib其是此酶的抑制剂导致白血病细胞的凋亡死亡，从而甚至在难治性或反复发作的形式中也给予更长的缓解。然而，上述治疗可能暴露于不良效应。在SLE和CLL的病理特征中，描述了在B细胞抗原受体BCR的刺激以后，在SLE和CLL中B细胞的钙信号通路收到干扰[2,3]。除钙信号通路的这些缺陷之外，SLE的B细胞特征还在于白细胞介素10IL-10的产生不足，其影响调节B淋巴细胞Breg的活性[4,5]。在SLE中Breg的活性的这种不足导致T淋巴细胞T细胞增殖的较少调节，其可能会再次有利于放大自身免疫过程[5]。CLL和SLE的诊断和预后是基于汇编的不完善的临床和生物学标准，因此需要开发新的、更有效的标准。在上述两种疾病中，B细胞是主要治疗靶。然而，一些患者并不响应现有治疗。因此，真正需要提供新的治疗解决方案，其克服现有技术的这些缺陷、缺点和障碍，并且尤其涉及治疗靶，其对于待治疗的疾病的受影响的细胞是易接近的，特异性的和选择性的。发明内容本发明通过使用STIM1蛋白涉及钙通道的激活和调节的蛋白的位于质膜的部分作为SLE和CLL的治疗靶，使得可以响应这些需求。令人惊讶地，本申请人还证明了用于直接或间接控制位于质膜的STIM1蛋白的活性的任何方式可以用于调节B细胞的细胞反应，从而提供SLE和CLL的新的治疗解决方案。本发明因此提出，在这种情况下，使用调节以下各项的任何工具：i位于质膜的STIM1蛋白的表达，ii这种蛋白的膜寻址membraneaddressing，或iii在淋巴细胞质膜处这种蛋白的生物活性。在本发明的上下文中，在狼疮患者的B细胞中令人惊讶地观测到：1STIM1蛋白的整体表达的增加，以及位于质膜的STIM1的部分的诱导，这在对照的B细胞中保持较低或甚至为零，2在具有位于质膜的STIM1的部分的SLE的B细胞在静止时中，尤其是在处于不成熟过渡期的SLE的B细胞中，借助于Erk12激酶细胞外信号调节激酶的磷酸化，MAPK通路促分裂原活化蛋白激酶的激活，3细胞外Ca2+的增加的组成型进入，以及4在STIM1的表达的增加、细胞外Ca2+的组成型进入持续进入，constitutiveentry和MAPKERK12途径的激活的失调之间的相关性，其可以解释细胞的一般激活，自身反应性B细胞的存活，因而可以解释自身免疫过程。在本发明的上下文中，关于SLE的Breg的活性，首次令人惊讶地观测到：x1Breg的缺乏调节活性与在SLE的B细胞中的STIM1分子的表达的增加相关，x2位于质膜的STIM1分子的阻断通过阻断抗体特异性地进行或者通过靶向在SLE的B细胞中STIM1的siRNA非特异性地进行的恢复i通过SLE的Breg的IL-10的生产，iiT细胞的增殖的抑制，以及iii调节性T细胞的诱导。在健康的对照中，位于质膜的STIM1的阻断没有影响。对于CLL的B细胞，申请人还令人惊讶地观测到：a胞浆内钙的基线水平的增加与CLL的B细胞的存活的增加、MAPKErk12途径的激活、转录因子NFAT2活化的T细胞的核因子和STAT3信号转导物和转录激活子3的核转位、以及IL-10的合成的增加[5]相关，b通过位于质膜的STIM1蛋白的增加来调节细胞外Ca2+的组成型进入的增加。cSTIM1蛋白在膜上存在组I或不存在组II允许区分两组患者。d针对在质膜处存在的STIM1分子的抗STIM1抗体能够极大减少细胞外Ca2+组成型进入组I的CLL的B细胞以及更弱进入组II的CLL的B细胞，e特异性靶向位于质膜的STIM1蛋白的部分的抗STIM1抗体和抗CD20抗体利妥昔单抗：RTX的组合能够恢复由组I患者的B细胞在质膜处存在STIM1蛋白中的RTX所诱导的凋亡效应。抗STIM1抗体的添加对组II患者在膜处不存在STIM1蛋白的抗CD20的凋亡效应没有影响。本发明提出，使用位于质膜的STIM1的部分作为在SLE和CLL中的新的治疗靶。本发明还提出，在这些疾病中使用位于质膜的STIM1的部分的调节物。本发明涉及位于质膜的STIM1的部分作为治疗靶通过调节它的存在或它的活性，在SLE和CLL中的用途。因此，本发明涉及除了别的之外i在细胞的质膜处，STIM1分子的表达的抑制，ii这种蛋白的膜寻址的抑制，以及iii在质膜处存在的STIM1蛋白的生物活性的抑制。提出了，特别是在耐RTX治疗的CLL患者中，通过特异性靶向位于质膜的STIM1蛋白的部分的抗STIM1抗体，来阻断位于质膜的STIM1的活性。事实上，提出了，通过STIM1的调节物如抗STIM1Ac的Ca2+的流入的调节其取决于位于质膜的STIM1的部分将使细胞对由RTX诱导的凋亡敏感。本发明在多个方面是有利的，特别是，标记物仅存在于受影响的细胞上，而不存在在健康细胞上，其允许获得特异性和选择性。此外，在质膜的水平上，通过免疫细胞的STIM1蛋白的表达会促进此靶的可接近性。因此，本发明的第一个目的涉及位于细胞质膜的STIM1蛋白的部分在以下方法中的用途，该方法用于筛选用于治疗SLE和或CLL的候选分子。在本发明的意义上，“位于细胞质膜的STIM1蛋白的部分”是指位于细胞质膜的STIM1蛋白的糖基化部分。STIM1蛋白具有两个糖基化位点，在位置131处的天冬酰胺以及在位置171处的另一个。STIM1分子的糖基化是用于寻址在细胞的表面上的STIM1分子的必要和必须的过程[7]。此部分具有约90±2kDa的分子量，这使得有可能将它与STIM1的非糖基化形式84±2kDa相区分。可以通过蛋白印迹来检测上述两种形式。人STIM1分子基质相互作用分子；也被称为GOK是具有序列IDNO:1的蛋白，该序列对应于Uniprot序列：Q13586或NCBI：NP_003147.2。这种蛋白由序列IDNO:2编码，该序列对应于NCBI序列：NM_003156.3mRNA转录物。优选地，上述部分位于完整细胞的质膜上，这意味着，质膜是非破碎的和或非透化的，并且有利地不允许非渗透性分子穿透细胞。“位于质膜的STIM1蛋白的部分”是指来自位于细胞质膜的STIM1蛋白的分离的任何生物产物。可以通过本领域技术人员已知的所有方式来进行分离，例如，但不限于，通过在差速离心以后使用洗涤剂例如，非离子型或离子型表面活性剂，如TritonX-100或TritonNl01；或聚氧乙烯脱水山梨醇酯，或通过使用靶向膜蛋白抗体，Thermoscientific磺基-NHS-SS-生物素的免疫化学或蛋白化学技术的步骤。在本发明的意义上，“细胞”是指在质膜的水平上表达STIM1的任何细胞。有利地，上述细胞是免疫细胞。它们可以是，例如，B细胞和T细胞。有利地，上述细胞是来自SLE或CLL患者的B细胞。可替换地，可以用序列IDNO:2来转染上述细胞以在它们的质膜上表达STIM1蛋白。优选地，上述细胞是整个细胞，换句话说，完整和或非破碎的细胞。因此，这样的细胞是不透化的。有利地，在本发明的筛选方法中使用的细胞是完整的以严格筛选这样的分子，该分子调节STIM1的膜表达和或调节细胞外Ca2+的组成型进入constitutiveentry。有利地，在本发明的筛选方法中使用的细胞是完整的以选择这样的分子，由于它们与位于质膜的STIM1蛋白的部分的特异性相互作用，其不穿透进入细胞并且其留在质膜处。换句话说，筛选方法允许选择非渗透分子，即，不穿过质膜的分子。上述细胞是分离的细胞，并且可以以样品的形式提供用于本发明的筛选方法。在本发明的意义上，“筛选方法”是指任何方法，该方法允许鉴定与STIM1蛋白的膜部分相互作用的物质，或者调节STIM1蛋白的膜部分的膜表达的物质。它可以是本领域技术人员已知的任何方法，例如生物筛选，例如，选自包括免疫荧光、蛋白印迹、免疫沉淀、表面等离子共振SPR、流式细胞术、视频显微、钙流的研究、酶联免疫吸附测试ELISA、和共焦显微镜术的组的技术，或者生物物理筛选，例如通过借助于荧光来测量细胞内钙浓度的变化。有利地，筛选方法允许确定这样的物质，其选择性地与位于细胞质膜的STIM1蛋白的部分相互作用，而没有渗透细胞。换句话说，筛选方法允许确定不渗透物质，其选择性地与位于细胞质膜的STIM1蛋白的部分相互作用。可以在体外，在含有完整细胞在它们的质膜上表达STIM1蛋白的样品上来实施筛选方法。在本发明的意义上，“候选分子”是指与位于细胞质膜的STIM1蛋白的部分相互作用的任何分子。相互作用可以是候选分子在位于细胞质膜的STIM1蛋白上固定的类型。可替换地，相互作用可以是这种蛋白的活性或表达的调节。位于质膜的STIM1蛋白的部分的活性的调节可以起因于在质膜中STIM1的插入的修饰，或起因于质膜的STIM1蛋白与关联于它的蛋白的相互作用的修饰。蛋白的活性的调节可反映于钙流的变化，如细胞内钙的组成型进入的变化，或在受体的刺激期间激活的钙流入的变化，如取决于储备的释放SOCE，钙库操纵性钙离子内流的钙流入。相对于在应用候选分子以前对相同细胞或者可比较的细胞测得的水平，表达的调节可以是位于质膜的STIM1蛋白的表达的增加或减小。STIM1蛋白的表达的调节可以，例如与转录修饰、表遗传修饰、或为STIM1蛋白的膜寻址不可缺少的糖基化过程的调节相关联。有利地，所选的候选分子特异性地与位于细胞质膜的STIM1蛋白的部分相互作用。在本发明的筛选方法中，因为所选的候选分子不穿过质膜，所以它们并不与位于内质网的STIM1蛋白相互作用。因此，本发明的目的是，分离的完整细胞在细胞的质膜上表达STIM1蛋白在体外筛选候选分子的方法中的用途，其中上述候选分子可用于治疗慢性淋巴细胞白血病和或系统性红斑狼疮。本发明的另一目的涉及体外确定可用于治疗慢性淋巴细胞白血病和或系统性红斑狼疮的物质的方法，包括以下步骤：a提供含有分离的整个细胞的样品，其中上述细胞在它们的表面上表达位于细胞质膜的STIM1蛋白的部分，b通过细胞与候选分子的相互作用来筛选候选分子，c选择候选分子，其结合位于细胞质膜的STIM1蛋白的部分而没有透过细胞，从而确定可用于治疗慢性淋巴细胞白血病和或系统性红斑狼疮的物质。本发明的第二个目的涉及这样的物质，其与位于细胞质膜的STIM1蛋白的部分相互作用，用作治疗SLE和或CLL的药用产品。在本发明的意义上，“物质”是指任何分子，其表现出：固定于位于质膜的STIM1蛋白的相互作用，或者STIM1蛋白的这种膜部分的活性或表达的调节的相互作用如上所定义的。上述物质可以具有天然或合成来源。它可以是通过化学方法产生的蛋白，或者通过生物工程的任何方法，如纯化所产生的蛋白。尤其可以通过应用，如上所定义的筛选方法来确定上述物质。有利地，上述物质不能穿过质膜并且特异性地与位于细胞质膜的STIM1蛋白的部分相互作用而没有渗透细胞。有利地，上述物质可以减小或阻断位于细胞质膜的STIM1蛋白的活性。上述物质可以是，例如一种抗体，其针对序列SEQIDNO:3的位于质膜的STIM1蛋白的细胞外片段。此序列对应于STIM1的氨基酸23-213。它可以是抗GOKSTIM1抗体克隆：44，BDBiosciences参考910954。本发明还涉及药物组合物，其包含至少一种如上所定义的物质。这样的组合物可以包含任何适宜的药用载体，其包含，例如赋形剂和添加剂，其促进在药学上可以使用的制备的物质的形成药剂。措辞“药学上可接受的”包括任何载体，其并不负面干扰用于治疗SLE或CLL的物质的功效，以及其对于它所给予的宿主是无毒的。尤其是，用于根据本发明的组合物的适宜的药学上可接受的载体是尤其适用于全身施加的载体。适宜的药学上可接受的载体在现有技术中是众所周知的，并且例如描述于此领域中的标准参考文本RemingtonPharmaceuticalSciencesMackPublishingCompany,Easton,USA,1985。它可以是，例如一种或多种组分，其选自柠檬酸钠、聚山梨酯80、氯化钠、氢氧化钠、盐酸和注射用水。有利地，根据本发明的组合物可以用作药用产品。特别有利地，本发明的组合物可以用作用于治疗SLE或癌症，如CLL的药用产品。本发明的药物组合物可以包含任何有效成分，其增强如上所定义的物质的效果。此外，本发明的药物组合物可以是抗CD20抗体或任何其它分子，其与蛋白复合物关联，该蛋白复合物调节与STIM1蛋白如蛋白Orai和TRPC关联的钙通道。在这种情况下，它可以是在人或动物疗法中已知的任何抗CD20，例如，但不限于IDEC-C2B8抗体利妥昔单抗，由Hoffman-LaRocheinEurope销售、DrugbankDB00073BIOD00014，BTD00014、奥法木单抗Arzera,GlaxoSmithKline、托西莫单抗GSK,DB00081,BIOD00085,BTD00085、阿托珠单抗Gazyva,Roche,DB08935,GA101、替伊莫单抗Tiuxetan,IDECPharmaceuticals,DB00078,BIOD00069,BTD00069、ublituximabLFB或AME-133vLilly,LY2469298。对于本领域技术人员而言，在阅读下文给出的附图所示的，用于说明而给出的实施例以后，其它优点也可能变得明显的。附图说明—图1通过蛋白印迹AB和流式细胞术CD示出在系统性红斑狼疮SLE的B淋巴细胞B细胞中的膜STIM1，以及在慢性淋巴细胞白血病CLL的B细胞中的膜STIM1。图A通过蛋白印迹示出在90kDa处在SLE的B细胞与健康对照的对照B细胞中STIM1的糖基化部分的条带。对于其在质膜中的插入而言，STIM1蛋白的这种糖基化是不可缺少的。图B通过蛋白印迹示出，相对于不表达膜STIM1mSTIM1-的对照CLLB细胞，在90kDa处在表达膜STIM1mSTIM1+的CLL的B细胞中位于膜的STIM1的部分的条带。图C通过流式细胞术示出，相对于不表达膜STIM1mSTIM1-的健康对照的对照B细胞，在表达膜STIM1mSTIM1+的SLE的B细胞中位于膜的STIM1的部分。图D通过流式细胞术示出，相对于与不表达膜STIM1mSTIM1-的对照CLLB细胞，在表达膜STIM1mSTIM1+的CLL的B细胞中位于膜的STIM1的部分。—图2示出通过抗STIM1抗体克隆Gok44，BDBiosciences的组成型钙流入的抑制，该抗体针对STIM1蛋白的细胞外表位，其中上述STIM1蛋白位于人JOKPLP的B细胞质膜[6]、系JOKCD5的B细胞质膜[6]、和慢性淋巴细胞白血病CLL的B淋巴细胞。图A和B示出组成型流入和抗STIM1抗体对这种组成型流入的影响的测量结果以dFFoa.u.为单位表示，任意单位，其是在多孔板中利用用于预处理细胞5μgml抗体60分钟的板式读数器，并借助于对照抗体CTRL，IgG2a同种型，BeckmanCoulter或借助于抗STIM1GOK抗体，在人JOKPLPA和JOKCD5B的B淋巴细胞中所测得。图C示出在借助于对照抗体CTRL，IgG2a同种型或借助于抗STIM1GOK抗体的用于预处理细胞的单细胞成像5μgml抗体，60分钟中，在CLL的B细胞上，组成型流入和抗STIM1抗体对这种流入量的影响作为比率dFFoa.u.的测量结果。图D示出缺乏抗STIM1抗体对钙流入的影响，其取决于由毒胡萝卜素1μM,Sigma-Aldrich诱导的并在CLL的B细胞中测得的储备SOCE钙库操纵性钙离子内流的释放。—图3示出，在根据在质膜处表达STIM1蛋白mSTIM1+或不表达STIM1蛋白mSTIM1-而分为两组的患者中，抗STIM1抗体克隆Gok44A单独或B与抗CD20抗体利妥昔单抗协同对细胞活力的影响，C对在慢性淋巴细胞白血病CLL的B细胞中的组成型钙进入Ca2+的影响，以及D通过系统性红斑狼疮SLE的B细胞，对抑制T淋巴细胞的增殖Breg活性的影响。图A示出，在10μgml同种型对照抗体同种型抗体，IgG2a同种型，BeckmanCoulter的存在下或在10μgml抗STIM1GOK抗体的存在下，在两组mSTIM1+或mSTIM1-中，对于CLL的B细胞，在培养48小时以后，活细胞的百分比。图B示出，在10μgml同种型对照抗体同种型抗体，IgG2a同种型，BeckmanCoulter的存在下，在10μgml利妥昔单抗抗CD20的存在下，或者在利妥昔单抗10μgml和抗STIM1GOK10μgml的组合存在下，在两组mSTIM1+或mSTIM1-中，对于CLL的B细胞，在培养48小时以后，CLL的活细胞的百分比。图C示出，在用5μgml抗STIM1GOK抗体来预治疗，或者未预治疗没有添加的对照细胞以后，在质膜处表达STIM1mSTIM1+的组的CLL的B细胞中Ca2+的组成型进入的减小表示为比率dFFoa.u.，任意单位。图D示出，在抗STIM1GOK抗体或无添加对照的存在下，在4天以后，在自体共培养1:1的模型中，以SLE的B细胞的百分比表示的细胞增殖的抑制。具体实施方式实施例实施例1：用于检测膜STIM1的方法在去除T淋巴细胞玫瑰花结技术，利用经神经氨酸酶预处理的绵羊红细胞和单核细胞负向消耗negativedepletion技术，没有CD43的B细胞试剂盒，StemCellTechnologies以后，从在Ficoll梯度上获得的外周血单核细胞PBMC纯化B淋巴细胞。通过流式细胞术来证实CD19阳性B细胞的纯度，其显示为高于95％的纯度。通过用SDS-PAGE的蛋白印迹进行的B细胞的AB-蛋白分析使得除STIM1的网状部分84±2kDa之外，能够区分SLEa和一些CLL患者B，mSTIM1+组的B细胞的STIM190±2kDa的糖基化膜形式。这种蛋白分析首先使用抗STIM1克隆Gok44抗体BDBiosciences，然后使用过氧化物酶连接的小鼠抗IgG抗体GEHealthcare，并且最后通过化学发光试剂盒ECLadvance,GEHealthcare加以检测。通过流式细胞术的CD分析包括在4℃下用抗STIM1克隆Gok44抗体BDBiosciences来温育纯化的B细胞15分钟，然后，在洗涤以后，使用荧光素连接的Fab'2小鼠抗IgG抗体JacksonLaboratories来显示抗STIM1抗体的固定。相对于同种型对照IgG2a,BeckmanCoulter来确定在活细胞中STIM1的膜标记。实施例2：筛选抗-膜STIM1分子的方法在人B细胞系JOK在质膜处表达STIM1蛋白上进行分子调节位于质膜的STIM1部分的筛选至第一近似firstapproximation。使用两种类型的细胞：用空载体JOKPLP稳定转染的或用CD5蛋白稳定转染的JOK细胞[6]。这些细胞表现出可测量的组成型钙进入。筛选由测量靶向位于细胞质膜的STIM1的部分的分子，对细胞外钙的组成型进入的影响组成。还评估了这些分子对钙进入的影响，这取决于储备SOCE钙库操作性钙进入的释放，以确定上述分子对作用于组成型钙进入的分子的流入SOCE的影响。通过利用荧光探针Calcium6,MolecularDevices来监测细胞内钙浓度的变化以测量两个钙流的幅度振幅，amplitude。以100000个细胞孔的比率，使细胞附着在经CellTakBDBiosciences处理的96孔板中45分钟。然后，在利用Flexstation类型的多孔板读取器MolecularDevices来测量细胞内钙浓度的变化之前，通过在上述探针存在下，温育60分钟，借助于荧光探针Calcium6,MolecularDevices来加载细胞。在借助于荧光探针来加载细胞时以及在细胞内钙浓度的变化的整个测量中，使细胞接触测试化合物。在缺少细胞的任何刺激之下，通过去除并然后添加细胞外基质的钙来估计组成型钙进入的测量结果。通过用毒胡萝卜素SERCA泵抑制剂来处理细胞，以激活流入SOCE。然后在纯化的B细胞其获自对照个体或CLL患者的外周血单核细胞PBMC，该B细胞在细胞的表面上的STIM1分子的表达水平是已知的以及通过流式细胞术测得来测试确定为对JOK细胞的感兴趣的钙流具有影响的分子。如上所述，通过单细胞荧光成像来测量测试分子对组成型钙流入和流入SOCE的影响。以500000个细胞条的比率，使细胞附着于涂布有CellTAKBDBiosciences的玻璃条45分钟，然后在利用单细胞荧光成像系统来测量细胞内钙浓度的变化以前，在普朗尼克酸pluronicacidSigmaAldrich的存在下，借助于荧光探针Fura2,Molecularprobes加载45分钟。在细胞的整个加载中以及在细胞内钙浓度的变化的整个测量中，使细胞接触测试化合物。在缺少细胞的任何刺激之下，通过去除以及然后添加细胞外基质的钙来估计组成型钙进入的测量结果。通过用毒胡萝卜素SERCA泵抑制剂处理细胞，以激活流入SOCE。从而证明，抗STIM1抗体克隆Gok44，BDBiosciences对组成型钙流入的抑制，该抗体针对位于细胞质膜的STIM1蛋白的细胞外表位。用在多孔板中的JOK细胞系和板式读数器图2AB或用在单细胞成像中的B淋巴细胞图2CD来测量组成型流入以及抗STIM1抗体对上述流入的影响。实施例3：用于证明抗-膜STIM1分子的生物活性和抗淋巴细胞B活性的方法图3图3A-以10μgml使用的抗STIM1抗体克隆Gok44，BDBiosciences能够降低CLL的B细胞的存活，对于mSTIM1+组在质膜处存在STIM1蛋白的CLL，存活增加。对于此实验，培养细胞48小时，然后确定活细胞缺乏膜联蛋白V碘化丙啶标记，BeckmanCoulter的百分比。图3B-抗STIM1抗体克隆Gok44增强抗CD20抗体利妥昔单抗，10μgml对mSTIM1+组的CLL的B细胞的死亡的作用。图3C-抗STIM1抗体克隆Gok44的影响涉及在CLLmSTIM1+的B细胞中抗体对Ca2+的组成型进入的影响。图3D-在CpG和抗CD3CD28的刺激的存在下，在自体培养4天后，抗STIM1抗体克隆Gok44恢复SLE的B细胞抑制细胞增殖的能力。参考文献[1]SeretG，HanrotelC，BendaoudB，LeMeurYandRenaudineauY.HomozygousFCGR3A-158FmutationisassociatedwithdelayedB-celldepletionfollowingrituximabbutwithpreservedefficacyinapatientwithrefractorylupusnephritis.ClinKidneyJ2012doi：10.1093ckjsfs162.[2]NédellecS，RenaudineauY，BordronA，BerthouC，PorakishviliN，LydyardPM，PersJO，YouinouP.BcellresponsetosurfaceIgMcross-linkingidentifiesdifferentprognosticgroupsofB-chroniclymphocyticleukemiapatients.JImmunol.2005174：3749-56.[3]LiossisSN，KovacsB，DennisG，KammerGM，TsokosGC.Bcellsfrompatientswithsystemiclupuserythematosusdisplayabnormalantigenreceptor-mediatedearlysignaltransductionevents.JClinInvest.199698：2549-57.[4]BlairPA，LY，Flores-BorjaF，RawlingsDJ，IsenbergDA，EhrensteinMR，MauriC.CD19+CD24hiCD38hiBcellsexhibitregulatorycapacityinhealthyindividualsbutarefunctionallyimpairedinsystemicLupusErythematosuspatients.Immunity.201032：129-40.[5]LemoineS，MorvaA，YouinouP，JaminC.HumanTcellsinducetheirownregulationthroughactivationofBcells.JAutoimmun.201136：228-38.[6]GaraudS，MorvaA，LemoineS，HillionS，BordronA，PersJO，BerthouC，MageedRA，RenaudineauY，YouinouP.CD5promotesIL-10productioninchroniclymphocyticleukemiaBcellsthroughSTAT3andNFAT2activation.JImmunol.2011186：4835-44.[7]MignenO，ThompsonJL，ShuttleworthTJ.STIM1regulatesCa2+entryviaarachidonate-regulatedCa2+-selectiveARCchannelswithoutstoredepletionortranslocationtotheplasmamembrane.JPhysiol.2007579：703-15.序列表西布列塔尼大学法国国家健康与医学研究院布雷斯特大学医疗中心使用膜STIM1筛选化合物的方法BNT218446PC00EP14290232.92014-08-063PatentInversion3.51685PRT智人1MetAspValCysValArgLeuAlaLeuTrpLeuLeuTrpGlyLeuLeu151015LeuHisGlnGlyGlnSerLeuSerHisSerHisSerGluLysAlaThr202530GlyThrSerSerGlyAlaAsnSerGluGluSerThrAlaAlaGluPhe354045CysArgIleAspLysProLeuCysHisSerGluAspGluLysLeuSer505560PheGluAlaValArgAsnIleHisLysLeuMetAspAspAspAlaAsn65707580GlyAspValAspValGluGluSerAspGluPheLeuArgGluAspLeu859095AsnTyrHisAspProThrValLysHisSerThrPheHisGlyGluAsp100105110LysLeuIleSerValGluAspLeuTrpLysAlaTrpLysSerSerGlu115120125ValTyrAsnTrpThrValAspGluValValGlnTrpLeuIleThrTyr130135140ValGluLeuProGlnTyrGluGluThrPheArgLysLeuGlnLeuSer145150155160GlyHisAlaMetProArgLeuAlaValThrAsnThrThrMetThrGly165170175ThrValLeuLysMetThrAspArgSerHisArgGlnLysLeuGlnLeu180185190LysAlaLeuAspThrValLeuPheGlyProProLeuLeuThrArgHis195200205AsnHisLeuLysAspPheMetLeuValValSerIleValIleGlyVal210215220GlyGlyCysTrpPheAlaTyrIleGlnAsnArgTyrSerLysGluHis225230235240MetLysLysMetMetLysAspLeuGluGlyLeuHisArgAlaGluGln245250255SerLeuHisAspLeuGlnGluArgLeuHisLysAlaGlnGluGluHis260265270ArgThrValGluValGluLysValHisLeuGluLysLysLeuArgAsp275280285GluIleAsnLeuAlaLysGlnGluAlaGlnArgLeuLysGluLeuArg290295300GluGlyThrGluAsnGluArgSerArgGlnLysTyrAlaGluGluGlu305310315320LeuGluGlnValArgGluAlaLeuArgLysAlaGluLysGluLeuGlu325330335SerHisSerSerTrpTyrAlaProGluAlaLeuGlnLysTrpLeuGln340345350LeuThrHisGluValGluValGlnTyrTyrAsnIleLysLysGlnAsn355360365AlaGluLysGlnLeuLeuValAlaLysGluGlyAlaGluLysIleLys370375380LysLysArgAsnThrLeuPheGlyThrPheHisValAlaHisSerSer385390395400SerLeuAspAspValAspHisLysIleLeuThrAlaLysGlnAlaLeu405410415SerGluValThrAlaAlaLeuArgGluArgLeuHisArgTrpGlnGln420425430IleGluIleLeuCysGlyPheGlnIleValAsnAsnProGlyIleHis435440445SerLeuValAlaAlaLeuAsnIleAspProSerTrpMetGlySerThr450455460ArgProAsnProAlaHisPheIleMetThrAspAspValAspAspMet465470475480AspGluGluIleValSerProLeuSerMetGlnSerProSerLeuGln485490495SerSerValArgGlnArgLeuThrGluProGlnHisGlyLeuGlySer500505510GlnArgAspLeuThrHisSerAspSerGluSerSerLeuHisMetSer515520525AspArgGlnArgValAlaProLysProProGlnMetSerArgAlaAla530535540AspGluAlaLeuAsnAlaMetThrSerAsnGlySerHisArgLeuIle545550555560GluGlyValHisProGlySerLeuValGluLysLeuProAspSerPro565570575AlaLeuAlaLysLysAlaLeuLeuAlaLeuAsnHisGlyLeuAspLys580585590AlaHisSerLeuMetGluLeuSerProSerAlaProProGlyGlySer595600605ProHisLeuAspSerSerArgSerHisSerProSerSerProAspPro610615620AspThrProSerProValGlyAspSerArgAlaLeuGlnAlaSerArg625630635640AsnThrArgIleProHisLeuAlaGlyLysLysAlaValAlaGluGlu645650655AspAsnGlySerIleGlyGluGluThrAspSerSerProGlyArgLys660665670LysPheProLeuLysIlePheLysLysProLeuLysLys67568068524062DNA智人2ctggacctgggcaccgccagccgcctgggcacgggactgggcgggggcgctgacctcggc60ctaggaggcccaggatcccggagacgcccgcgccctcaggaccctgcgggtcgcacgccc120tccccagcttctgctgctcgccgctcttcggcagggcgaggtcaggtgcccccttctcgc180ctctcttctcttctcttctcttcctcctccacttctgtgcccgcggagactccggccgcc240cccttccgcaggggtgtagtaatctgcggagctgacagcagccccgcagccaccctgccc300gaagtctccggaagcggcacgagctcaggccgccgcagccccggcggacccactgttgga360cctgaggagccagccctcctcccgcacccaaacttggagcacttgacctttggctgttgg420agggggcaggctcgcgggtggctggacagctgcggagccgcgagggcatcttgcctggag480accgtcggctgcactcccgggctcctggctttgcctctgggatcccgaggtgtccacatc540agacgcatgttgactgagacctagagtcatggatgtatgcgtccgtcttgccctgtggct600cctctggggactcctcctgcaccagggccagagcctcagccatagtcacagtgagaaggc660gacaggaaccagctcgggggccaactctgaggagtccactgcagcagagttttgccgaat720tgacaagcccctgtgtcacagtgaggatgagaaactcagcttcgaggcagtccgtaacat780ccacaaactgatggacgatgatgccaatggtgatg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权利要求：1.位于细胞的质膜的STIM1蛋白的分离部分在一种方法中的用途，所述方法用于体外筛选用于治疗慢性淋巴细胞白血病和或系统性红斑狼疮的候选分子，其中，所述细胞是分离的整个细胞。2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述STIM1蛋白的肽序列是序列SEQIDNO:1。3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，筛选的方法使用选自包括生物筛选和生物物理筛选的组中的技术。4.根据权利要求3所述的用途，其中，筛选使用选自包括以下各项的组中的技术：免疫荧光、蛋白印迹、免疫沉淀、表面等离子共振、流式细胞术、视频显微术、钙流的研究、酶联免疫吸附测试、和共焦显微术。5.体外确定对于治疗慢性淋巴细胞白血病和或系统性红斑狼疮有用的物质的方法，包括以下步骤：a提供含有分离的整个细胞的样品，所述细胞在它们的表面表达位于细胞的质膜上的STIM1蛋白的部分，b通过使所述细胞与候选分子相互作用来筛选所述候选分子，c选择候选分子，所述候选分子结合位于所述细胞的质膜的STIM1蛋白的部分，而没有穿过所述细胞，从而确定对于治疗慢性淋巴细胞白血病和或系统性红斑狼疮有用的物质。6.根据权利要求5所述的方法，其中，筛选候选分子的步骤b使用选自包括生物筛选和生物物理筛选的组中的技术。7.根据权利要求5所述的方法，其中，筛选候选分子的步骤b使用选自包括以下各项的组中的技术：免疫荧光、蛋白印迹、免疫沉淀、表面等离子共振、流式细胞术、视频显微术、钙流的研究、酶联免疫吸附测试、和共焦显微术。

百度查询： 西布列塔尼大学;法国国家健康与医学研究院;布雷斯特大学医疗中心 使用膜STIM1筛选化合物的方法

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