申请/专利权人：内蒙古金源康生物工程有限公司

申请日：2018-12-26

公开（公告）日：2019-04-16

公开（公告）号：CN109628411A

主分类号：C12N7/00(2006.01)I

分类号：C12N7/00(2006.01)I;C12N5/071(2010.01)I;A61K39/135(2006.01)I;A61P31/14(2006.01)I;C12R1/93(2006.01)N

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2019.11.08#授权;2019.05.10#实质审查的生效;2019.04.16#公开

摘要：本发明公开了一种FMD抗原增强培养基及其制备方法与应用，培养基包括：氨基酸、无机盐、维生素及水解物，还包括：细胞周期阻断剂、糖类、双肽及小分子肽；培养基的制备方法包括：称取、溶解、过滤并除菌等步骤；疫苗的制备包括:BHK‑21细胞的复苏、细胞的扩增培养、病毒接种、换液等工艺。本发明在现有技术的基础上，在培养基中加入了抗原增强因子即细胞周期阻断剂，并且在病毒培养的过程中，增加了一步换液工艺，提高了抗原的活性、增强病毒滴度，显著提高了疫苗的抗病毒效率。

主权项：1.一种FMD抗原增强培养基，包括：氨基酸、无机盐、维生素及水解物，其特征在于，还包括：细胞周期阻断剂、糖类、双肽及小分子肽。

全文数据：一种FMD抗原增强培养基及其制备方法与应用技术领域本发明涉及生物工程技术领域，更具体地说是涉及一种FMD抗原增强培养基及其制备方法与应用。背景技术口蹄疫，简称FMD，是人和偶蹄兽的一种急性发热性高度接触性传染病，其临床症状表现为口腔粘膜、蹄部和乳房皮肤发生水泡和溃烂；口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一类传染性疾病，口蹄疫病毒属于小核糖核酸科。这种病毒已知有多个亚型，且多个亚型之间免疫原性不同，不能产生交叉免疫。目前，FMD抗原的培养基中主要含有氨基酸类、糖类、维生素类及无机盐类等物质，在制备FMD疫苗的过程中，常常需要加入FMD抗原培养基，以提供适合FMD抗原繁殖的生长环境。但是现有的FMD抗原培养基在制备疫苗中的作用并不明显，得到的FMD的灭活抗原量并不理想。因此，如何提供一种能显著增加FMD抗原量的培养基及其制备方法与应用是本领域技术人员亟需解决的问题。发明内容有鉴于此，本发明提供了一种FMD抗原增强培养基及其制备方法与应用，在现有技术的基础上，在培养基中加入了抗原增强因子即细胞周期阻断剂，并且在病毒培养的过程中，增加了一步换液工艺，提高了抗原的活性、增强病毒滴度，从而显著提高疫苗的抗病毒效率。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种FMD抗原增强培养基，包括：氨基酸、无机盐、维生素及水解物，还包括：细胞周期阻断剂、糖类、双肽及小分子肽。可选的，所述FMD抗原增强培养基还包括：硫辛酸、环庚三烯酚酮、酚红钠盐、F-68、还原型谷胱甘肽、次黄嘌呤钠盐、及丙酮酸钠中的一种或多种。可选的，所述细胞周期阻断剂包括：胸苷、含羞草碱、阿非迪霉素、噻氯酯达唑、秋水仙碱中的一种或多种。可选的，所述糖类包括D-葡萄糖及糖类衍生物。可选的，所述双肽包括丙谷二肽和双甘肽。可选的，所述小分子肽的分子量大小包括：3-50kd可选的，所述多种水解物包括：棉籽水解物、酵母超滤物、大米水解物及麦麸水解物中的一种或多种。一种FMD抗原增强培养基的制备方法，包括下述步骤：1按照体积比，称取上述原料，并将所述原料混合均匀，得到混合原料；2向容器中注入水至900ml，加入所述混合原料，轻微搅拌溶解；3向所述容器中加入碳酸氢钠，使其最终浓度为2.5gL，轻微搅拌使之溶解，加注射用水至1L，得到初始培养基；4将所述初始培养基用0.2μm滤膜正压过滤除菌，得到FMD抗原增强培养基；5将所述FMD抗原增强培养基放置2-8℃下密闭避光保存。可选的，在所述步骤3之后、所述步骤4之前还包括：用1molL氢氧化钠溶液或1moLL盐酸溶液调节所述初始培养基的pH值至7.5-7.8。一种FMD抗原增强培养基在制备FMD疫苗中的应用。一种利用FMD抗原增强培养基制备疫苗的方法，包括下述步骤：1BHK-21细胞的复苏；2扩增BHK-21细胞至100-3000L反应器中；3细胞沉降后将原培养液上清去除，加入权利要求5所述的FMD抗原增强培养基；4按照比例加入口蹄疫病毒，继续培养10-20h后，待细胞病变90％以上，收获病毒液；5病毒灭活、纯化后制备得到灭活抗原。6灭活抗原与佐剂按照比例乳化制备口蹄疫疫苗制剂。现有技术中，培养基包括：L-丙氨酸、L-谷氨酰胺等氨基酸、维生素、无机盐及糖类。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明达到的技术效果是：1本发明公开提供了一种FMD抗原增强培养基，细胞周期化学阻断剂包括胸苷、秋水仙碱、阿非迪霉素等，其可调控细胞周期，使BHK-21细胞被口蹄疫病毒侵染后，尽快处于同一细胞周期，而同步的细胞周期利于病毒的增殖，使得病毒产量增加；2利用双肽丙谷二肽和双甘肽等替换常规的谷氨酰胺、利用糖类衍生物：壳聚糖、酵母多糖、银耳多糖、二磷酸果糖或磷酸葡萄糖部分替代葡萄糖或D-葡萄糖，可减少有毒代谢产物的产生；小分子肽从鱼胨蛋白、胶原蛋白、大豆蛋白、棉籽蛋白、大米蛋白、麦麸蛋白中提取，其分子量大小为＜5kd、＜10kd、＜50kd其中一种或多种分子量范围的多肽组合，可促进病毒在细胞中复制；3添加锌、铁、铜等微量元素的螯合物，增加微量元素被BHK-21细胞利用的效率，刺激病毒繁殖。4FMD抗原增强培养基中加入多种氨基酸、维生素及无机盐，为病毒的增殖及BHK-21细胞的生长提供必要的营养物质。5本发明在病毒培养的过程中，增加了一步换液工艺，即待BHK-21细胞沉降后将其培养液的上清去除，加入FMD抗原增强培养基，再按照比例加入口蹄疫病毒，继续培养，FMD抗原量约提高至不换液的1.5倍-2倍。综上所述，本发明公开的FMD抗原增强培养基增加了疫苗中FMD灭活抗原的数量，提高了疫苗的质量和抗病毒效果。具体实施方式下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例一本发明为最佳实施例，具体公开了一种FMD抗原增强培养基，包括L-丙氨酸100mgL、L-精氨酸盐酸盐200mgL、L-天冬氨酸100mgL、L-天冬酰胺300mgL、L-半胱氨酸10mgL、L-谷氨酸50mgL、L-异亮氨酸100mgL、L-亮氨酸100mgL、L-赖氨酸盐酸盐100mgL、L-蛋氨酸35mgL、无水氯化钙100mgL、氯化钠5000mgL、磷酸氢二钠10mgL、六水氯化镁50mgL、无水硫酸镁2mgL、氯化钾40mgL、一水磷酸二氢钠20mgL、生物素0.005mgL、维生素C1mgL、维生素E0.005mgL、维生素D0.005mgL、氯化胆碱0.5mgL、D-泛酸钙0.2mgL、棉籽水解物600mgL、酵母超滤物500mgL、D-葡萄糖3000mgL、壳聚糖100mgml、丙谷二肽600mgL、双甘肽100mgL、胸苷0.5mgL、硫辛酸0.05mgL、环庚三烯酚酮8mgL、酚红钠盐6mgL、F-6850mgL、还原型谷胱甘肽0.01mgL、次黄嘌呤钠盐0.1mgL、4kd的小分子肽100mgL及丙酮酸钠100mgL；制备方法为：1按照体积比，称取上述原料，并将所述原料混合均匀，得到混合原料；2向容器中注入水至900ml，加入所述混合原料，轻微搅拌溶解；3向所述容器中加入碳酸氢钠，使其最终浓度为2.5gL，轻微搅拌使之溶解，加注射用水至1L，得到初始培养基；用1molL氢氧化钠溶液或1moLL盐酸溶液调节所述初始培养基的pH值至7.5。4将所述初始培养基用0.2μm滤膜正压过滤除菌，得到FMD抗原增强培养基；5将所述FMD抗原增强培养基放置2℃下密闭避光保存。利用FMD抗原增强培养基制备疫苗的方法为：1BHK-21细胞的复苏；2扩增BHK-21细胞至100L反应器中；3细胞沉降后将原培养液上清去除，加入本实施例中的FMD抗原增强培养基；4按照比例加入口蹄疫病毒，继续培养10h后，待细胞病变90％以上，收获病毒液；5灭活、纯化后制备抗原。6抗原与佐剂按一定比例乳化制备口蹄疫疫苗。将本实施例中制备的培养基标号为①，将完全以D-葡萄糖作为糖原、没有壳聚糖及其他衍生物的培养基标号为②，现申请人分别用两种培养基按照本实施例中制备疫苗的方法进行试验，得到的抗原浓度和细胞内毒素的结果如表一；表一抗原146S含量μgml内毒素EUml①7.02②6.958将本实施例的培养基标号为①、将未加入胸苷、其它组分与本实施例一致的培养基标号为③，将加入与胸苷相同质量的含羞草碱、其它组分与本实施例一致的培养基标号为⑤、将加入与胸苷相同质量的秋水仙碱、其它组分与本实施例一致的培养基标号为⑥、将加入与胸苷相同质量的阿非迪霉素、其它组分与本实施例一致的培养基标号为⑦、将加入与胸苷相同质量的噻氯酯达唑、其它组分与本实施例一致的培养基标号为⑧，根据本实施例中制备疫苗的方法制备疫苗，疫苗的抗原浓度、细胞毒素；培养基的渗透压及pH值的对比见表二：表二将本实施例的培养基标号为①、将加入大豆蛋白或鱼胨蛋白或麦麸蛋白、去除小分子肽、其它组分与本培养基一致的培养基标号为④，根据本实施例中制备疫苗的方法制备疫苗，疫苗的抗原浓度、细胞毒素；培养基的渗透压及pH值的对比见表三；表三实施例二一种FMD抗原增强培养基，包括：L-色氨酸150mgL、L-酪氨酸二钠盐100mgL、L-缬氨酸185mgL、L-胱氨酸盐酸盐85mgL、L-组氨酸盐酸盐150mgL、L-赖氨酸500mgL、甘氨酸90mgL、一水磷酸二氢钠50mgL、七水合硫酸锌0.7mgL、九水合硝酸铁0.6mgL、亚硒酸钠0.03mgL、五水硫酸铜0.003mgL、硫酸亚铁0.2mgL、核黄素0.6mgL、钴胺素3mgL、盐酸硫胺素0.5mgL、肌醇8mgL、棉籽水解物4000mgL、酵母超滤物4000mgL、大米水解物2000mgL、麦麸水解物4000mgL、D-葡萄糖、酵母多糖100mgml、丙谷二肽1200mgL、双甘肽250mgL、含羞草碱0.5mgL、硫辛酸0.6mgL、环庚三烯酚酮8mgL、酚红钠盐15mgL、F-68600mgL、还原型谷胱甘肽0.9mgL、次黄嘌呤钠盐5mgL、60kd的小分子肽500mgL、丙酮酸钠250mgL。一种FMD抗原增强培养基的制备方法，包括下述步骤：1按照体积比，称取上述原料，并将原料混合均匀，得到混合原料；2向容器中注入水至900ml，加入混合原料，轻微搅拌溶解；3向容器中加入碳酸氢钠，使其最终浓度为2.5gL，轻微搅拌使之溶解，加注射用水至1L，得到初始培养基；用1molL氢氧化钠溶液或1moLL盐酸溶液调节初始培养基的pH值至7.8；4将初始培养基用0.2μm滤膜正压过滤除菌，得到FMD抗原增强培养基；5将FMD抗原增强培养基放置2℃下密闭避光保存。利用FMD抗原增强培养基制备疫苗的方法为：1BHK-21细胞的复苏；2扩增BHK-21细胞至100L反应器中；3细胞沉降后将原培养液上清去除，加入本实施例中的FMD抗原增强培养基；4按照比例加入口蹄疫病毒，继续培养15h后，待细胞病变90％以上，收获病毒液；5灭活、纯化制备抗原。6抗原与佐剂按一定比例乳化制备口蹄疫疫苗。将本实施例中制备的培养基标号为1、将完全以D-葡萄糖作为糖原、没有酵母多糖及其他衍生物的培养基标号为2，现申请人分别用两种培养基按照本实施例中制备疫苗的方法进行试验，得到的抗原浓度和细胞内毒素的结果如表四；表四抗原146S含量μgml内毒素EUml18.242.8927.858.46将本实施例的培养基标号为1、将未加入含羞草碱、其它组分与本培养基一致的培养基标号为3，根据本实施例中制备疫苗的方法制备疫苗，疫苗的抗原浓度、细胞毒素；培养基的渗透压及pH值的对比见表五：表五本实施例的培养基标号为1、将加入大豆蛋白或鱼胨蛋白或麦麸蛋白、去除小分子肽、其它组分与本培养基一致的培养基标号为4，根据本实施例中制备疫苗的方法制备疫苗，疫苗的抗原浓度、细胞毒素；培养基的渗透压及pH值的对比见表六；表六实施例三一种FMD抗原增强培养基，包括：L-丙氨酸140mgL、L-谷氨酰胺245mgL、L-精氨酸盐酸盐245mgL、L-天冬氨酸130mgL、L-缬氨酸156mgL、L-胱氨酸盐酸盐62mgL、L-组氨酸盐酸盐100mgL、L-赖氨酸320mgL、甘氨酸70mgL、硒酸钠0.02mgL、五水硫酸铜0.0002mgL、硫酸亚铁0.55mgL、生物素0.75mgL、维生素C6mgL、维生素E0.075mgL、维生素D0.75mgL、氯化胆碱0.775mgL、D-泛酸钙1.1mgL、叶酸4mgL、烟酰胺6mgL、盐酸吡哆醇7mgL、磷酸吡哆醛0.2mgL、核黄素0.4mgL、钴胺素2mgL、盐酸硫胺素0.25mgL、肌醇6mgL、棉籽水解物2000mgL、酵母超滤物2000mgL、大米水解物1000mgL、麦麸水解物2000mgL、D-葡萄糖4000mgL、银耳多糖150mgml、丙谷二肽800mgL、双甘肽125mgL、秋水仙碱0.23mgL、硫辛酸0.3mgL、环庚三烯酚酮5mgL、酚红钠盐10mgL、F-68300mgL、还原型谷胱甘肽0.45mgL、次黄嘌呤钠盐0.26mgL、8kd小分子肽300mgL及丙酮酸钠162mgL。一种FMD抗原增强培养基的制备方法，包括下述步骤：1按照上述体积比，称取上述原料，并将原料混合均匀，得到混合原料；2向容器中注入水至900ml，加入混合原料；3向容器中加入碳酸氢钠，使其浓度为2.5gL，轻微搅拌使之溶解，加注射用水至1L，得到初始培养基；用1molL氢氧化钠溶液或1moLL盐酸溶液调节初始培养基的pH值至7.64将初始培养基用0.2μm滤膜正压过滤除菌，得到FMD抗原增强培养基；5将FMD抗原增强培养基放置2℃下密闭避光保存；用本实施例中的FMD抗原增强培养基制备疫苗的方法为:1BHK-21细胞的复苏；2扩增BHK-21细胞至3000L反应器中；3细胞沉降后将原培养液上清去除，加入本实施例中的FMD抗原增强培养基；4按照比例加入口蹄疫病毒，继续培养20h后，待细胞病变90％以上，收获病毒液；5灭活、纯化后制备抗原。6抗原与佐剂按一定比例乳化制备口蹄疫疫苗。将本实施例中制备的培养基标号为5、将完全以D-葡萄糖或葡萄糖作为糖原、没有银耳多糖及其他衍生物的培养基标号为6，现申请人分别用两种培养基按照本实施例中制备疫苗的方法进行试验，得到的抗原浓度和细胞内毒素的结果如表七；表七抗原146S含量μgml内毒素EUml59.052.3168.679.71将本实施例的培养基标号为5、将未加入阿非迪霉素或噻氯酯达唑、其它组分与本培养基一致的培养基标号为7，根据本实施例中制备疫苗的方法制备疫苗，疫苗的抗原浓度、细胞毒素；培养基的渗透压及pH值的对比见表八：表八本实施例的培养基标号为5、将加入大豆蛋白或鱼胨蛋白或麦麸蛋白、去除小分子肽、其它组分与本培养基一致的培养基标号为8，根据本实施例中制备疫苗的方法制备疫苗，疫苗的抗原浓度、细胞毒素；培养基的渗透压及pH值的对比见表九；表九实施例四疫苗的制备：1、BHK-21细胞的复苏采用商品化BHK-21细胞悬浮培养用低血清培养基，按照标示量称取培养基干粉溶解于注射用水中，加入碳酸氢钠后用稀碱调节PH值至7.0-7.4，正压过滤除菌后用于细胞复苏与培养。BHK-21细胞来自疫苗生产厂家，工作细胞库的细胞代次，应不超过主细胞库的10代，BHK-21工作细胞应在10个代次内。置于振荡摇床培养，每48h进行传代，经逐级扩大至生产用3000L反应器中。2、病毒的接种与培养各自不同血清型的口蹄疫病毒株分别培养，工作细胞库细胞经培养48h后，停止搅拌，待细胞沉淀后去除上清培养液，加入与上清培养液同等体积的实施例三中的FMD抗原增强培养基，口蹄疫病毒液按照FMD抗原增强培养基体积的1-3％比例加入，继续培养10-20h后，待细胞病变大达90％以上，收获毒液；所述的口蹄疫病毒毒株可为O型株和A型株。本实施例中采用O和A型口蹄疫毒株作为制备疫苗的病毒株进行了以下研究。3、病毒液澄清、微滤、透析、纯化译澄清、微滤、透析：病毒粗制液通过过滤澄清进一步除去细胞碎片以及小部分杂质，用μm的中空纤维柱进行澄清、微滤，超滤透析口蹄疫病毒液；层析纯化：高倍浓缩溶液置于装Separate6FF层析柱，用pH7.0的磷酸缓冲液平衡，用紫外分光光度计检测洗脱液，260nm波长检查核酸，280nm检测蛋白。采用DEAE阴离子柱纯化，病毒则流出穿过，收集贮存于2℃，得到纯化病毒液纯化抗原，得到的抗原数量和理化效果检测见表十和表十一：表十：抗原数量的测定其中，表中①号表示在制备疫苗的过程中，未添加培养基；②号代表添加的是现有的培养基；③号代表添加的是实施例三中的培养基；由上述表十一可知：在培养基中加入细胞周期阻断剂可明显提高病毒的产量，即抗原量提高至1.5倍左右。表十一：FMD抗原增强培养基理化指标检测及性能特点由表十一可知：使用本发明的培养基，细胞产生的内毒素仅为2EU，内毒素少。经48小时培养的BHK-21细胞替换至FMD抗原增强培养基中，继续培养24小时细胞形态正常，活率＞95％。实施例五、口蹄疫疫苗攻毒试验结果表十二疫苗种类动物数量抗体反应口蹄疫症状副反应①10+++无无②10+++无+++③10+++严重无①为实施例2制备的疫苗；②为现有技术中的疫苗；③未加入灭活抗原的疫苗；实施例六：牛的免疫效力试验以12只牛进行实验，其中8只牛为免疫组，4只牛为对照组，免疫组的牛分别在颈部皮下接种实施例四制备的疫苗标号为①：2只0.5ml、2只0.75ml、2只1ml、2只2ml；对照组2只不接种疫苗，标号为②，2只接种经过不换液工艺制备的疫苗标号为③；一个月后，分别接种口蹄疫病毒，效果见表十三：表十三由表十三可知：增加一步换液工艺，其最终得到的疫苗会产生更强的免疫效果，在动物体内的抗体滴度提高了1～1.5倍。说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

权利要求：1.一种FMD抗原增强培养基，包括：氨基酸、无机盐、维生素及水解物，其特征在于，还包括：细胞周期阻断剂、糖类、双肽及小分子肽。2.根据权利要求1所述的一种FMD抗原增强培养基，其特征在于，还包括：硫辛酸、环庚三烯酚酮、酚红钠盐、F-68、还原型谷胱甘肽、次黄嘌呤钠盐、及丙酮酸钠中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的一种FMD抗原增强培养基，其特征在于，所述细胞周期阻断剂包括：胸苷、含羞草碱、阿非迪霉素、噻氯酯达唑、秋水仙碱中的一种或多种。4.根据权利要求3所述的一种FMD抗原增强培养基，其特征在于，所述糖类包括D-葡萄糖及糖类衍生物。5.根据权利要求4所述的一种FMD抗原增强培养基，其特征在于，所述小分子肽的分子量大小包括：3-50kd。6.根据权利要求5所述的一种FMD抗原增强培养基，其特征在于，所述多种水解物包括：棉籽水解物、酵母超滤物、大米水解物及麦麸水解物中的一种或多种。7.一种FMD抗原增强培养基的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：1按照体积比，称取上述原料，并将所述原料分类混合均匀，得到混合原料；2向容器中注入水至900ml，加入所述混合原料，轻微搅拌溶解；3向所述容器中加入碳酸氢钠，使其最终浓度为2.5gL，轻微搅拌使之溶解，加注射用水至1L，得到初始培养基；4将所述初始培养基用0.2μm滤膜正压过滤除菌，得到FMD抗原增强培养基；5将所述FMD抗原增强培养基放置2-8℃下密闭避光保存。8.根据权利要求7所述的一种FMD抗原增强培养基的制备方法，其特征在于，在所述步骤3之后、所述步骤4之前还包括：用1molL氢氧化钠溶液或1moLL盐酸溶液调节所述初始培养基的pH值至7.5-7.8。9.一种FMD抗原增强培养基在制备FMD疫苗中的应用。10.一种FMD疫苗的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：1BHK-21细胞的复苏；2扩增BHK-21细胞至100L反应器中；3细胞沉降后将原培养液上清去除，加入权利要求5所述的FMD抗原增强培养基；4按照比例加入口蹄疫病毒，继续培养10-20h后，待细胞病变90％以上，收获病毒液；5病毒灭活、纯化后制备得到灭活抗原。6灭活抗原与佐剂按照比例乳化制备口蹄疫疫苗制剂。

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