申请/专利权人：中国科学院化学研究所

申请日：2019-04-25

公开（公告）日：2019-06-21

公开（公告）号：CN109908119A

主分类号：A61K31/11(2006.01)I

分类号：A61K31/11(2006.01)I;A61P35/00(2006.01)I

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2022.07.22#发明专利申请公布后的驳回;2019.07.16#实质审查的生效;2019.06.21#公开

摘要：本发明实施例公开了一种LRPPRC负调控剂及用途,本发明实施方式相对于现有技术而言，以肿瘤细胞中的高表达LRPPRC为治疗靶点，以醋酸棉酚为靶向治疗药物，通过两者的特异性结合达到抑制肿瘤细胞生长的目的，同时，醋酸棉酚是已经在临床适用的化合物，安全性高，给药方式简单，同时原料来源广泛，价格低廉，降低了患者的治疗成本。

主权项：1.一种LRPPRC负调控剂，其特征在于，包含能够负调控LRPPRC的醋酸棉酚。

全文数据：LRPPRC负调控剂及用途技术领域本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种LRPPRC负调控剂及用途。背景技术癌症是一类引起人类死亡的主要疾病，每年全球因癌症死亡人数大约为700万。现阶段由于癌症早期诊断和筛查技术的不足，很大一部分癌症病人在初次就诊时就已经是处于肿瘤晚期，丧失了手术切除治愈的机会。化疗以及放疗仍然是现阶段晚期肿瘤的主要治疗手段。然而，这种治疗方法疗效有限，绝大部分病人最终都会复发，此外该种方法具有非常大的副作用，极大的降低了患者的生存质量。肿瘤靶向治疗是针对肿瘤特异性表达的功能分子，设计开发靶向性的抑制剂包括抗体、小分子、生物载体等。该类靶向性分子可以特异性抑制肿瘤细胞的生长、运动及化疗抵抗等功能，而对正常的组织细胞不具有破坏作用。因此，靶向治疗可以极大的延长患者的生存时间及生存质量，因此提供一种新型的肿瘤靶向治疗药物是目前亟需解决的问题。发明内容本发明实施方式的目的在于提供一种LRPPRC负调控剂及用途，提供了一种与LRPPRC特异性结合进行肿瘤治疗的醋酸棉酚，且醋酸棉酚是已经在临床适用的化合物，安全性高，给药方式简单，同时原料来源广泛，价格低廉。为解决上述技术问题，第一方面，本发明提供一种LRPPRC负调控剂，其包含能够负调控LRPPRC的醋酸棉酚。第二方面，本发明提供LRPPRC负调控剂用于抑制LRPPRC功能的用途。进一步，所述LRPPRC负调控剂结合到LRPPRC的RNA结合域，从而抑制LRPPRC对RNA的结合。进一步，所述的LRPPRC负调控剂为醋酸棉酚。第三方面，本发明提供LRPPRC负调控剂用于降解LRPPRC蛋白中的用途。进一步，所述的LRPPRC负调控剂为醋酸棉酚。第四方面，本发明提供一种选择对醋酸棉酚敏感的肿瘤组织或细胞的方法，其包括检测所述肿瘤组织或细胞中LRPPRC的表达量。其中，与正常组织或细胞相比，如果所述肿瘤组织或细胞中LRPPRC高表达，则所述肿瘤组织或细胞对醋酸棉酚敏感。如果与正常组织或细胞相比，所述肿瘤组织或细胞中LRPPRC表达量无显著升高，则所述肿瘤组织或细胞对醋酸棉酚不敏感。第五方面，本发明提供醋酸棉酚在制备治疗抗肿瘤药物中的用途，其中源自所述肿瘤的组织或细胞是LRPPRC高表达的。其中，所述肿瘤选自LRPPRC高表达的结肠癌、直肠癌、食管癌、肺癌、肺鳞癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、乳腺导管癌。本发明实施方式相对于现有技术而言，以肿瘤细胞中的高表达LRPPRC为治疗靶点，以醋酸棉酚为靶向治疗药物，通过两者的特异性结合达到抑制肿瘤细胞生长的目的，同时，醋酸棉酚是已经在临床适用的化合物，安全性高，给药方式简单，同时原料来源广泛，价格低廉，降低了患者的治疗成本。附图说明一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，附图中具有相同参考数字标号的元件表示为类似的元件，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。图1是本发明实施例1LRPPRC在多种肿瘤中的高表达示意图；图2是本发明实施例2中850种小分子化合物抑制LRPPRC与核酸结合的效果图；图3是本发明实施例2中19种候选小分子化合物偏振光抑制率示意图；图4是本发明实施例3中不同GAA浓度下LRPPRC蛋白的荧光光谱变化曲线；图5是本发明实施例3中不同GAA浓度下GAA与LRPPRC的等温滴定曲线；图6是本发明实施例4中不同GAA浓度、不同时间下LRPPRC蛋白的变化趋势图；图7是本发明实施例4中GAA处理肿瘤细胞后，肿瘤细胞中LRPPRC蛋白对CDK6的mRNA的富集量。具体实施方式为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施例中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。LRPPRC富含亮氨酸的三角状五肽重复基序蛋白是一种线粒体蛋白，它的突变与细胞色素c氧化酶缺陷cytochromecoxidasedeficiency及Leigh综合征LeighSyndrome的发生密切相关。申请人前期大量研究工作表明，LRPPRC蛋白是肿瘤中切实可用的治疗性靶点，然而现阶段仍然没有能够与LRPPRC特异性的小分子抑制剂，因此提供一种能够与LRPPRC特异性的小分子抑制剂是目前亟需解决的问题。实施例1LRPPRC在多种肿瘤中的表达情况在公共数据库TCGA上分析了LRPPRC的RNA在各种肿瘤组织及正常组织中的表达程度，从图1中可以看出，在诸如包括结肠癌、直肠癌、食管癌、肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、乳腺导管癌等多种肿瘤中都显著高表达。为提供一种能够与LRPPRC高表达肿瘤细胞特异性结合的抑制剂，在大量实验的基础上，本发明实施例从以下方面对醋酸棉酚GAA与LRPPRC的特异性结合进行了验证：实施例2高通量筛选LRPPRC小分子抑制剂GAA本实施例基于核酸适配体的高通量药物筛选体系，从含有850种天然产物的小分子化合库中筛选能够抑制LRPPRC与核酸适配体结合功能的小分子。从图2看出，总计19种化合物可以阻碍LRPPRC与核酸适配体的结合。从图3看出GAA显示出较强的LRPPRC抑制功能。具体的筛选方法如下：1体外原核表达纯化出LRPPRC的RNA结合区域C-domain蛋白质；2体外合成荧光素标记的LRPPRC特异性结合的核酸适配体R14-flu；3配置LRPPRC与R14-flu的复合物体系，以PBS作为缓冲液，浓度为LRPPRC120ugml，R14-flu40nM，于黑色不透光的384孔板中，每孔加入15ul的LRPPRC与R14-flu的复合物；4将850种小分子化合物用PBS分别稀释为60uM的储备液，于384孔板每个孔加入10ul，以DMSO孔作为对照，室温作用5min；5InfiniteM1000PROplate酶标仪对每个孔的荧光信号以及偏振光信号分别进行采集，与DMSO孔的信号进行归一化处理，计算每种小分子加入后，统计偏振光的抑制率以及荧光信号自身的变化倍数，以偏振光的抑制率为横坐标，以荧光信号自身的变化倍数为纵坐标得到图1，如图1所示，总计19种小分子化合物可以阻碍LRPPRC与核酸适配体的结合。需要说明的是，本实施例中的筛选方法筛选的原则是偏振光信号的抑制率大于50％，而荧光值自身的变化小于1.5倍。由于偏振光也受到荧光分子自身的荧光信号强度的影响，本实施例需要保证小分子加入后偏振光的变化是因为蛋白与与核酸适配体的结合被抑制了，而不是小分子的加入降低了荧光分子的荧光信号导致的针对19种候选小分子化合物的偏振光抑制率进行统计，统计结果如图3所示，其中GAA显示出最大的偏振光抑制能力，也就是GAA能最有效的抑制LRPPRC蛋白与核酸适配体的结合。实施例3本实施例分别采用荧光滴定及等温量热的方法，检测LRPPRC与GAA的直接结合。一、荧光滴定法测定GAA与LRPPRC蛋白的直接结合1体外原核表达纯化出LRPPRC的RNA结合区域C-domain蛋白质60ugml；2配置GAA的储备液浓度为50mM；3在LRPPRC蛋白液中添加浓度梯度的GAA，分别为0，0.25，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16，32uM；4采用FLS980fluorescencespectrometerEdinburghInstruments,Ltd.荧光光谱仪检测LRPPRC蛋白在300-380nm波段额荧光值变化。绘制在不同GAA浓度下LRPPRC蛋白的荧光光谱变化，具体如图4所示，从图4可以看出，随着GAA浓度的增加，LRPPRC蛋白的自发荧光逐渐降低。二、等温量热法ITC测定GAA与LRPPRC蛋白的直接结合1体外原核表达纯化出LRPPRC的RNA结合区域C-domain蛋白质60ugml；2配置GAA的储备液浓度为50mM；3将GAA储备液分步滴入LRPPRC蛋白缓冲液，iTC200instrumentMicroCal,GE等温量热仪记录每次加入GAA后温度变化，实验结果如图5所示，从图5可以看出，GAA与LRPPRC的混合后有显著的放热现象。由上可知，荧光滴定及等温量热实验都证实LRPPRC与GAA存在直接结合。实施例4验证GAA抑制LRPPRC的分子功能实验本实施例主要从两个方面验证GAA对LRPPRC有抑制作用，具体如下：一、GAA直接降解LRPPRC蛋白1肺腺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MCF7、肺癌细胞系H1299、乳腺癌细胞系BT474、乳腺癌细胞系MCF7、肺癌细胞系H460培养至对数生长期，加入浓度梯度的GAA0、1、5、10uM，培养48小时后，离心收集细胞，裂解后获取细胞全蛋白。40ug总蛋白用于westernblot检测LRPPRC蛋白的变化趋势；2肺腺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MCF7、肺癌细胞系H1299、乳腺癌细胞系BT474、乳腺癌细胞系MCF7、肺癌细胞系H460培养至对数生长期，采用终浓度为10uM的GAA进行时间梯度实验，分别处理0、8、16、24小时。离心收集细胞，裂解后获取细胞全蛋白。40ug总蛋白用于westernblot检测LRPPRC蛋白的变化趋势，LRPPRC蛋白的变化趋势如图6所示。二、RIP实验RNAImmunoprecipitation验证GAA影响CDK6的mRNA与LRPPRC蛋白的结合：1胰酶消化收集肺腺癌细胞系A549、乳腺癌细胞系MCF7、肺癌细胞系H1299、乳腺癌细胞系BT474、乳腺癌细胞系MCF7、肺癌细胞系H460，裂解细胞提取细胞裂解液，往细胞裂解液中添加终浓度10uM的GAA，以添加DMSO的样品作为NC对照。2每管添加2ug的LRPPRC抗体abcam公司，货号ab97505及50ul的proteinAG磁珠，四度转盘上过夜孵育。孵育后，PBS洗涤，提取proteinAG磁珠上富集的mRNA，逆转录后进行Realtime-PCR扩增，检测CDK6的mRNA丰度，用DMSO处理样本的富集量进行归一化统计分析，统计结果如图7所示。由图6可知，在用GAA处理肿瘤细胞后，LRPPRC的蛋白水平显著下降。由图7可知，在用GAA处理肿瘤细胞后，用LRPPRC特异性抗体捕获到的能与LRPPRC特异性结合的CDK6的mRNA是显著减少的，说明GAA也可以阻断LRPPRC与CDK6mRNA的结合。综上所述，GAA可以通过降低LRPPRC基因表达或减弱LRPPRC蛋白活性来抑制肿瘤细胞的生长，从而达到治疗LRPPRC高表达肿瘤疾病的目的。本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。

权利要求：1.一种LRPPRC负调控剂，其特征在于，包含能够负调控LRPPRC的醋酸棉酚。2.LRPPRC负调控剂用于抑制LRPPRC功能的用途。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述LRPPRC负调控剂结合到LRPPRC的RNA结合域，从而抑制LRPPRC对RNA的结合。4.LRPPRC负调控剂用于降解LRPPRC蛋白中的用途。5.如权利要求2～4任一项所述的用途，其特征在于，所述的LRPPRC负调控剂为醋酸棉酚。6.一种选择对醋酸棉酚敏感的肿瘤组织或细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：检测所述肿瘤组织或细胞中LRPPRC的表达量。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，与正常组织或细胞相比，如果所述肿瘤组织或细胞中LRPPRC高表达，则所述肿瘤组织或细胞对醋酸棉酚敏感。8.醋酸棉酚在制备治疗抗肿瘤药物中的用途，其特征在于，所述肿瘤的组织或细胞是LRPPRC高表达的。9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自LRPPRC高表达的结肠癌、直肠癌、食管癌、肺癌、肺鳞癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、乳腺导管癌。

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