申请/专利权人：中国水产科学研究院黄海水产研究所

申请日：2018-12-19

公开（公告）日：2020-07-28

公开（公告）号：CN109535246B

主分类号：C07K14/61(20060101)

分类号：C07K14/61(20060101);C07K1/34(20060101);C07K1/14(20060101);C12N15/18(20060101);C12N15/70(20060101);C12N1/21(20060101);A23K50/80(20160101);A23K20/147(20160101);C12R1/19(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.28#授权;2019.04.23#实质审查的生效;2019.03.29#公开

摘要：本发明提供了一种编码黄条鰤GH蛋白的基因及蛋白重组表达方法与应用属于基因工程技术领域，具体公开了编码黄条鰤GH蛋白的基因并利用该基因编码黄条鰤GH蛋白，本发明对编码黄条鰤GH蛋白的原始基因序列进行改造，并将该基因构建原核表达载体和重组大肠杆菌菌株，利用重组大肠杆菌菌种在体外获得大量表达的黄条鰤GH蛋白，该蛋白能够用于制备促进黄条鰤生长的促生长剂或添加剂。

主权项：1.一种编码黄条鰤GH蛋白的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

全文数据：编码黄条鰤GH蛋白的基因及蛋白重组表达方法与应用技术领域本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种黄条鰤GH基因、编码蛋白及其应用，所述应用为在制备促生长剂或饲料添加剂中的应用。背景技术黄条鰤Seriolalalandi属于鲈形目Perciformes、鲹科Carangidae、鰤属Seriola，是一种全球性分布的海洋中上层暖温性远洋洄游鱼类，具有生长速度快、肉质鲜嫩、适合网箱养殖和循环水养殖等优点，黄条鰤逐渐成为世界范围内水产养殖的一个新品种。2017年，中国水产科学研究院黄海水产研究所科研人员利用海陆接力培育方式保育黄条鰤亲鱼300多尾，通过人工综合调控亲鱼性腺发育成熟，自然产卵，获得了批量受精卵；采用工厂化育苗方法，培育出平均体长13.6cm、平均体重28.4g的黄条鰤大规格苗种23000多尾，在国内首次获得黄条鰤人工繁育的成功。脊椎动物生长主要受到生长激素-胰岛素样生长因子轴的调控。通常认为，垂体分泌生长激素growthhormone,GH，GH通过其受体GHreceptor,GHR作用于肝脏以及其他位点，进而促进胰岛素样生长因子insulin-likegrowthfactor,IGF的合成和分泌，后者再通过其受体IGFreceptor,IGFR作用于靶器官，促进细胞的增殖和分化。人们早已认识GH作为一种促生长剂的重要性，它可以用作饲料添加剂等用于水产养殖，进而促进鱼类生长。然而，尚未见有关黄条鰤GH的相关报道。发明内容本发明要解决的技术问题在于提供一种编码黄条鰤GH蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。所述序列是根据黄条鰤GH基因序列SEQIDNO：2进行改造后得到，其目的是得到该基因编码重组黄条鰤GH蛋白。进一步，所述黄条鰤GH蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：3。本发明的另一目的在于提供一种含有编码黄条鰤GH蛋白的表达载体pQE30-GH，所述载体的构建方法是按常规方法，利用合成的SEQIDNO：1，经酶切和分离纯化后，接入到载体pQE30的相应酶切位点，即BamHI和HindIII之间，即构建成所需的含有编码黄条鰤GH蛋白的表达载体pQE30-GH。本发明的另一目的在于提供含有上述载体转化的大肠杆菌菌株pQE30-GH-M15，所述菌株pQE30-GH-M15由含有编码黄条鰤GH蛋白的表达载体pQE30-GH转化大肠杆菌M15而得到。本发明还提供了利用上述大肠杆菌重组株生产黄条鰤GH蛋白的方法。将该菌种接种在LB液体培养基中，37℃，220转分培养14-16小时，按照1:100接种在1LLB液体培养基中，37℃，220转分培养至OD600达到0.6，然后加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃，220转分培养4小时后5000g离心10min收集菌体，超声破碎后12000g离心10min收集上清，经分离纯化得到重组黄条鰤GH蛋白。本发明还提供了重组黄条鰤GH蛋白的脱盐和浓缩的方法，将纯化得到的重组黄条鰤GH蛋白加入到透析袋中，在1×PBS，1mMDTT，PH8.0中4℃透析过夜。然后把透析后的蛋白溶液加入到超滤管中，4℃，6000g离心1-2小时，去掉滤出液，得到脱盐后的重组黄条鰤GH蛋白。黄条鰤具有重大的经济价值，采用常规的基因工程技术，可利用本发明的黄条鰤GH基因重组株pQE30-GH-M15，生产重组黄条鰤GH蛋白，并可进一步用作制备适合黄条鰤使用的促生长剂或添加剂。本发明与现有技术相比具有以下有益效果：本发明首次扩增编码黄条鰤GH蛋白的基因进行改造得到编码黄条鰤GH的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1，并将该基因构建表达载体和重组大肠杆菌菌株，利用重组大肠杆菌菌种在体外获得大量表达的黄条鰤GH蛋白，所述方法能够得到该基因编码重组黄条鰤GH蛋白，表达效率为0.44mgmL，重组黄条鰤GH蛋白能够用于制备促进黄条鰤生长的促生长剂或添加剂。附图说明图1.是重组质粒pQE30-GH的酶切鉴定凝胶电泳分析图，其中，M：Marker；1：pQE30-GHBamHI和HindIII双酶切。图2.A和B是重组株pQE30-GH-M15表达产物GH的SDS-PAGE电泳分析图及Westernblot鉴定图，其中：M：蛋白Marker；1：空载体对照；2：未诱导；3：是用IPTG诱导4小时；C是重组株pQE30-GH-M15表达产物GH纯化产物的SDS-PAGE电泳分析图；其中，M：蛋白Marker；1：纯化前样品；2：流出液；3-5：纯化后重组黄条鰤GH蛋白。图3.透析浓缩后的重组黄条鰤GH蛋白电电泳分析图M：蛋白Marker，1、重组黄条鰤GH蛋白；图4.是重组黄条鰤GH蛋白对黄条鰤原代肝细胞生长相关基因IGFⅠ和IGFⅡ表达的影响；A是IGFⅠ；B是IGFⅡ。其中不同字母有显著性差异P＜0.05。具体实施方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不以任何形式限制本发明。实施例1：含编码黄条鰤GH蛋白的基因大肠杆菌表达载体pQE30-GH的构建合成的黄条鰤GH基因和pQE30载体用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切后，酶切产物用GelExtractionKit回收，进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化编码黄条鰤GH基因片段和pQE30载体；用TAKARAT4连接酶16℃连接过夜后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌TOP10中，用LB平板筛选转化子，以标准方法提取质粒，用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切重组质粒，得到大和小两个片段，大小分别与编码黄条鰤GH蛋白的基因和表达载体pQE30大小相同，证明编码黄条鰤GH蛋白的基因已克隆入大肠杆菌表达载体pQE30中，重组质粒命名为pQE30-GH。酶切分析图分别见图1。实施例2：能高效表达黄条鰤GH的大肠杆菌重组株pQE30-GH-M15的构建制备好的重组质粒pQE30-GH用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌M15感受态细胞中，在LB平板上37℃进行培养。过夜后长出单克隆，挑取大肠杆菌工程菌pQE30-GH-M15单菌落接种在10mlLB液体培养基中，37℃，220转分培养过夜，然后按照1:100的比例接种于10mlLB液体培养基中，37℃，220转分培养至OD600到0.6，然后加入IPTG使其终浓度为0.5mM，37℃，220转分培养4小时后5000g离心10min收集菌体，弃上清，菌体用500μlPBS缓冲液悬浮，超声破碎6min，超0.5s停1.5s，分别离心收集上清和沉淀，沉淀用500μl包涵体溶解液8MUrea，50mMTris-HCl，300mMNaCl，PH8.0溶解，分别取40μl样品和10μl5×proteinloadingbuffer混匀，沸水浴10min，进行SDS-PAGE验证。结果见图2中的A。将重组黄条鰤GH蛋白采用免疫印迹Westernblot方法进行鉴定。一抗为鼠抗His单克隆抗体购自上海生工生物工程技术服务有限公司，二抗为羊抗鼠IgG-HRP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。结果见图2中的B。实施例3：利用大肠杆菌基因工程菌pQE30-GH-M15生产重组黄条鰤GH挑取大肠杆菌工程菌pQE30-GH-M15单菌落接种在10mlLB液体培养基中，37℃，220转分培养过夜，然后按照1:100的比例接种于1LLB液体培养基中，37℃，220转分培养至OD600到0.6，然后加入IPTG使其终浓度为0.5mM，37℃，220转分培养4小时后5000g离心10min收集菌体，超声破碎后12000g离心10min收集上清，经用GE公司的HisTrap进行纯化处理。取8μl蛋白溶液加入2μl5×loadingbuffer，煮沸10分钟后SDS-PAGE凝胶电泳验证，结果见图2中的C。将纯化得到的重组黄条鰤GH蛋白加入到透析袋中，在1×PBS，1mMDTT，PH8.0中4℃透析过夜。然后把透析后的蛋白溶液加入到超滤管中，4℃，6000g离心1-2小时，去掉滤出液，得到脱盐后的重组黄条鰤GH蛋白，电泳分析图谱如图3所示。采用SK3071非干扰型蛋白定量试剂盒上海生工生物工程技术服务有限公司测定蛋白浓度为0.44mgmL。实施例4：重组黄条鰤GH的功能研究—对黄条鰤原代肝细胞生长相关基因IGFⅠ和IGFⅡ表达量的影响分离黄条鰤原代肝细胞后，用加入10％FBS的含有酚红的L15培养基把细胞浓度调成5×105细胞ml，然后在24孔板中每孔加入1ml，放在28℃的生化培养箱中，培养过夜后，换成500μl的无FBS的L15培养基饥饿1小时，然后向处理组中每孔分别加入500μl的浓度为20、200、2000nM的分离纯化后的重组黄条鰤GH，对照组加入等体积的无血清培养基，在28℃的生化培养箱中培养12h用TRIzolThermoFisherscientific裂解细胞后完全收取裂解液。提取样品中总RNA，用M-MLV试剂盒ThermoFisherscientific进行反转录。荧光定量PCR试剂盒TOYOBO检测生长相关基因的变化情况，结果显示，与对照组相比，用GH处理原代肝细胞12小时后能够显著的增加IGFⅠ表达的水平，并且呈现剂量依存效应；对IGFⅡ的基因表达也有增加的趋势。结果如图4。序列表中国水产科学研究院黄海水产研究所编码黄条鰤GH蛋白的基因及蛋白重组表达方法与应用3SIPOSequenceListing1.01564DNA人工序列ArtificialSequence1cagccaatcactgatagccaacacctgttctccatcgctgtaagccgtatccagaacctg60cacctgctggctcaacgtctgttctctaacttcgaaagcactctgcagactgaggaacag120cgtcaactgaacaagatcttcctgcaggacttctgcaactccgactacatcatcagccct180atcgacaagcacgagacccagcgttctagcgtcctgaaactgctgtctatttcctaccgc240ctggttgagtcttgggaattctccagccgtttcctgtctggtggttctgctctgcgtaac300cagatttccccgcgtctgtctgaactgaaaaccggtattcagctgctgattaccgcaaac360caggacggtgcagaaatgttttccgatgtgtccgccctgcagctggcgccgtatggcaat420ttttaccagtctctgggcggcgaagaactgctgcgccgcaactatgaactgctggcctgt480tttaaaaaagatatgcataaagtggaaacctacctgacggttgcgaaatgccgcctgagc540ccggaagcgaattgtaccctgtaa5642564DNA黄条鰤Seriolaaureovittata2cagccaatcacagacagccagcatctgttctccatcgctgtcagcagaatccaaaacctc60cacctgctcgctcagagactcttctccaacttcgagagtactctgcagacggaggagcag120cgtcaactcaacaaaatcttcctacaggatttctgtaactctgattacatcatcagtccc180attgacaagcatgagacacaacgcagctctgttctgaagctgttatcgatctcctatcga240ttggtggagtcttgggagttctccagtcgctttctgtctggaggttctgctctgaggaac300cagatttcacccagactgtctgaactcaagacaggaatccaactgctgatcacagccaat360caggacggagcagagatgttctctgacgtctcggccctccagctcgctccatatggaaac420ttctatcagagtctgggaggcgaag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权利要求：1.一种编码黄条鰤GH蛋白的基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.权利要求1所述基因编码的黄条鰤GH蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO：3。3.一种含有编码黄条鰤GH蛋白的表达载体pQE30-GH，所述载体包含有权利要求1所述的SEQIDNO：1。4.权利要求3所述载体的构建方法，利用合成的SEQIDNO：1，经酶切和分离纯化后，接入到载体pQE30的相应酶切位点，即BamHI和HindIII之间，即构建成所述表达载体pQE30-GH。5.一种菌株pQE30-GH-M15，所述菌株pQE30-GH-M15是由权利要求4所述表达载体pQE30-GH转化大肠杆菌M15而得到。6.利用权利要求5所述菌株pQE30-GH-M15生产重组黄条鰤GH蛋白的方法，具体为将菌株pQE30-GH-M15接种在LB液体培养基中，37℃，220转分培养14-16小时，按照1:100接种在LB液体培养基中，37℃，220转分培养至OD600达到0.6，然后加入IPTG至终浓度为0.5mM，37℃，220转分培养4小时后离心并收集菌体，超声破碎后、离心、收集上清，经分离纯化得到重组黄条鰤GH蛋白。7.根据权利6所述的方法，其特征在于将纯化得到的重组黄条鰤GH蛋白加入到透析袋中，在1×PBS，1mMDTT，PH8.0中4℃透析过夜；然后把透析后的蛋白溶液加入到超滤管中，4℃，6000g离心1-2小时，去掉滤出液，得到脱盐后的重组黄条鰤GH蛋白。8.权利要求6或7所述方法得到的重组黄条鰤GH蛋白在制备促进黄条鰤生长的促生长剂或添加剂中的应用。

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