申请/专利权人：贵州省烟草科学研究院

申请日：2016-10-09

公开（公告）日：2020-10-09

公开（公告）号：CN107090461B

主分类号：C12N15/29(20060101)

分类号：C12N15/29(20060101);C12N15/10(20060101);C12N15/82(20060101);A01H5/12(20180101);A01H6/82(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.09#授权;2017.09.19#实质审查的生效;2017.08.25#公开

摘要：本发明提供了一种烟草HKT1基因，序列如SeqIDNo.1所示，所述HKT1基因的制备方法，包括以下步骤：设计PCR扩增引物；提取烟草细胞总RNA；合成烟草细胞cDNA；以烟草细胞cDNA为模板进行HKT1基因的PCR扩增得到目的片段，测序后得到HKT1基因序列。所述的HKT1基因全长1488bp，经功能验证，本发明所述的HKT1基因转入钾吸收缺陷型酵母突变株R5421后的重组酵母具有钾离子吸收和转运功能，烟草植株中超量表达HKT1基因可促进烟草对钾离子的吸收，本发明所述的HKT1基因具有促进钾离子吸收和转运的功能。

主权项：1.一种烟草HKT1基因在促进烟草植株钾离子吸收和转运方面的应用，其特征在于，将所述的烟草HKT1基因转入到烟草植株中，使HKT1基因超量表达以提高烟草植株的烟叶中钾离子的含量，所述HKT1基因的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。

全文数据：一种烟草HKT1基因及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种烟草HKTl基因及其制备方法和应用。背景技术[0002]钾离子通道是允许钾离子特异通透质膜的离子通道，而阻碍其他离子通透-特别是钠离子。这些通道一般由两部分组成：一部分是通道区，选择并允许钾离子通过，而阻碍钠离子;另一部分是门控开关，根据环境中的信号而开关通道。[0003]高亲和性K+转运蛋白HKTHigh-affinity!+Transporter属于膜转运蛋白家族，其主要功能是介导K+和Na+的共转运或仅介导Na+的转运。目前已经从许多植物小麦，拟南芥，水稻等）中克隆到这个基因（Schachtmanetal1994;邵群，2006;;植物HKTl可以分成两种类型，一种是高亲和K转运体（Horieetal2001，一种是Na+选择性的的转运体Uozumietal2000。烟草是一种耗钾量很大的作物，烟叶钾含量是衡量烟叶品质的的重要指标，目前，对于烟草中钾离子通道的研究较少，烟草HKTl的功能未知。发明内容[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供烟草HKTl基因及其制备方法和应用。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：[0005]本发明提供了一种烟草HKTl基因，所述HKTl基因的序列如SeqIDNo.1所示。[0006]本发明提供了上述技术方案所述HKT1基因的制备方法，包括以下步骤:设计PCR扩增引物，所述的PCR扩增引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的核苷酸序列为：5’-ATGATCCTTTCATTGTTAGG-3’，所述的反向引物的核苷酸序列为5’-TTATAATACTTTCCAGCCC-3’；提取烟草细胞总RNA;合成烟草细胞的cDNA;以所述烟草细胞cDNA为模板进行HKTl基因的PCR扩增，得到目的片段，测序后得到HKTl基因序列。[0007]优选的，所述PCR扩增引物的设计是以NCBIReferenceSequence:XM_009601690.1为参考序列，使用软件primer5设计得到的，所述XM_009601690.1的核苷酸序列如SeqIDNo.2所示。[0008]优选的，所述的PCR扩增的体系为20yL体系，包括PremixExTaqIOyL，10μΜ的正向引物0.5μί，10μΜ的反向引物0.5yL，烟草细胞cDNAlyL，ddH2〇8yL。[0009]优选的，所述的PCR扩增的反应程序为：95°C预变性5min;95°C变性30s;55°C退火30s;72°C延伸2min;35个循环。[0010]优选的，所述的目的片段在测序之前还包括，将所述目的片段导入大肠杆菌DH5a感受态细胞中进行菌落PCR验证，验证为阳性克隆后进行测序。[0011]优选的，所述菌落PCR验证使用的正向引物核苷酸序列为:5’-ATGATCCTTTCATTGTTAGG-3’，菌落PCR验证使用的反向引物核苷酸序列为:5’-TTATAATACTTTCCAGCCC-3’。[0012]优选的，所述菌落PCR验证的体系为10yL，包括PremixExTaq5yL，ΙΟμΜ的正向引物0.5yL，1ΟμΜ的反向引物0.5yL，ddH2〇4yL。[0013]本发明还提供了一种烟草HKTl基因在促进烟草植株钾离子吸收和转运方面的应用。[0014]优选的，将所述的烟草HKTl基因转入到烟草植株中，使HKTl基因超量表达以提高烟草植株的烟叶中钾离子的含量。[0015]本发明的有益效果:本发明提供的HKTl基因，是通过同源克隆的方法制备获得的，所述的HKTl基因全长1488bp，经功能验证，本发明提供的HKTl基因转入钾吸收缺陷型酵母突变株R5421后的重组酵母具有钾离子吸收，转运功能。本发明实施例中，3个HKTl基因转基因烟草叶中钾离子的质量含量分别是1.6%，1.2%，1.9%，非转基因的烟草叶中钾离子的质量含量是0.84%，转基因的烟草叶中钾离子的含量显著高于非转基因的，可见，烟草植株中超量表达HKTl基因可促进烟草对钾离子的吸收。因此，本发明提供的HKTl基因具有促进钾离子吸收和转运的功能。附图说明[0016]图1为实施例2中HKTl基因转入钾吸收缺陷型酵母突变株R5421后的重组酵母在钾离子浓度为OmM和2mM的培养基上的生长情况;其中图IA为钾离子浓度为OmM的培养基上的生长情况，图IB为钾离子浓度为2mM的培养基上的生长情况；[0017]图中，1为转入HKTl基因的重组酵母，2为阴性对照P416,3为阳性对照;从左到右依次为原液、10倍稀释液、100倍稀释液在培养基上的生长结果。具体实施方式[0018]本发明提供了一种烟草HKTl基因，所述烟草钾离子通道基因的序列如SeqIDNo.1所示，本发明中所述的HKT1基因全长1488bp。[0019]本发明提供了上述技术方案所述烟草HKTl基因的制备方法，包括以下步骤:设计PCR扩增引物；提取烟草细胞总RNA;合成烟草细胞cDNA;以所述烟草细胞cDNA为模板进行HKTl基因的PCR扩增，得到目的片段，测序后得到HKTl基因序列。[0020]本发明中，所述的PCR扩增引物的设计，是以NCBIReferenceSequence:XM_009601690.1为参考序列，使用软件primer5设计得到的，所述XM_009601690.1的序列如SeqIDNo.2所示。[0021]在本发明中，所述的PCR扩增引物优选包括正向引物和反向引物，所述的正向引物核苷酸序列为:5’-ATGATCCTTTCATTGTTAGG-3’，长度为20bp;所述反向引物的核苷酸序列为5’-TTATAATACTTTCCAGCCC-3’，长度为19bp。[0022]本发明在进行HKTl基因的PCR扩增之前，提取烟草细胞总RNA，并将提取得到的总RNA反转录为cDNA。在本发明中，所述的烟草细胞总RNA的提取采用本领域常用的提取细胞总RNA的技术方案即可，本发明的实施例中具体的可采用TriZO1法。在本发明中，所述的烟草细胞总RNA提取的原料为烟草的新鲜叶片，所述烟草采用为本领域常规的烟草品种，本发明实施例中，所述烟草品种为K326。[0023]本发明在提取得到烟草细胞总RNA后，将所述烟草细胞总RNA反转录合成cDNA。本发明中，所述的cDNA的合成，采用本领域常规的cDNA的合成方法即可，无其他特殊要求;具体的本发明实施例中采用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒完成cDNA的合成。[0024]本发明在得到cDNA之后，进行HKTl基因PCR扩增，得到目的片段。在本发明中，所述HKTl基因PCR扩增的体系优选为20yL体系，包括PremixExTaq10μί，10μΜ的正向引物0.5yL，1〇μΜ的反向引物0.5yL，烟草细胞cDNAUiL，ddH208yL。在本发明中，所述HKTl基因的PCR扩增的反应程序优选为:95°C预变性5min;95°C变性30s;55°C退火30s;72°C延伸2min;35个循环。[0025]本发明在HKTl基因PCR扩增得到目的片段后，将所述目的片段进行测序，得到HKTl基因。本发明在所述的PCR扩增后优选的对目的片段进行纯化，本发明对所述纯化的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的DNA纯化试剂盒进行即可。[0026]本发明在所述纯化完成后，优选将所述纯化后的目的片段导入大肠杆菌DH5a感受态细胞中进行菌落PCR验证，验证为阳性克隆后进行测序。本发明在得到阳性克隆后，优选的采用菌落PCR的方法来验证阳性克隆。在本发明中，所述菌落PCR的所述的正向引物核苷酸序列为：5’-ATGATCCTTTCATTGTTAGG-3’；所述反向引物的核苷酸序列为5’-TTATAATACTTTCCAGCCC-3’，所述菌落PCR的体系为10μL，包括PremixExTaq5μL，10μM的正向引物0.5yL，1ΟμΜ的反向引物0.5yL，ddH204yL。在本发明中，所述的将纯化后的目的片段导入大肠杆菌DH5a感受态细胞所采用的方法为本领域常规的转化大肠杆菌感受态细胞的方法，具体的在本发明实施例中采用以下方法:将所述目的片段与PMD19-T载体在16°C的条件下连接10〜14h，得到连接产物;将所述连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，得到转化后的大肠杆菌DH5a;将所述的转化后的大肠杆菌DH5a接种于涂有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选培养，得到阳性克隆。[0027]本发明在菌落PCR验证阳性克隆后，优选的，从已验证的阳性克隆中随机选取2〜4个独立的阳性克隆进行测序，得到所述的HKTl基因的序列。基于HKTl基因的钾离子吸收和转运性能，本发明还提供了一种烟草HKTl基因在促进烟草植株钾离子吸收和转运方面的应用。本发明将所述的烟草HKTl基因转入到烟草植株中，使HKTl基因超量表达以提高烟草植株的烟叶中钾离子的含量。在本发明中，将所述的烟草HKTl基因转入到烟草植株的方法优选的为农杆菌介导法。[0028]下面结合实施例对本发明提供的HKTl基因及其功能验证方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0029]实施例1[0030]取0.5g烟草新鲜叶片，采用Trizol法提取烟草细胞的总RNA，然后采用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒合成cDNA，进一步采用Primer5.0软件设计并经过人工优化得到引物，所述引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物核苷酸序列为:5’-ATGATCCTTTCATTGTTAGG-3’，所述反向引物的核苷酸序列为5’-TTATAATACTTTCCAGCCC-3’，以合成的cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系为为20yL体系，包括PremixExTaq10μί，10μΜ的正向引物0.5μUlOyM的反向引物0.5yL，烟草细胞cDNAlyL，ddH208yL;所述的PCR扩增的反应程序为:95°C预变性5min;95°C变性30s;55°C退火30s;72°C延伸2min;35个循环。[0031]PCR扩增完成后，使用DNA纯化试剂盒进行目的片段的纯化，将纯化后的目的片段与PMD19-T载体16°C连接12h得到连接产物，将所述得到的连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞得到转化后的大肠杆菌DH5a，将所述的转化后的大肠杆菌DH5a接种于涂有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选培养得到阳性克隆。在得到阳性克隆后，采用菌落PCR的方法来验证阳性克隆，所述菌落PCR的正向引物为:5’-ATGCCGTTGCCAGAGACACCGA-3’，反向引物为:5’-TCAAAAGATATACAAGCGATC-3’；所述菌落PCR的体系为10yL，包括PremixExTaq5μί，10μΜ的正向引物0.5yL，1ΟμΜ的反向引物0.5yL，CldH2O4yL。然后从已验证的阳性克隆中随机选取3个独立的阳性克隆送到生物技术公司进行测序，本发明在测序后得到所述的HKTl基因的序列，如SeqIDNo.1所示。[0032]实施例2[0033]将连接有实施例1中所述的HKTl基因的T-载体与表达载体P416分别进行双酶切酶切位点为:XbaI和SmaI，回收目的基因和表达载体P416，然后用连接酶连接，将连接后的重组酵母表达载体转入大肠杆菌DH5a的感受态细胞，对转化后的大肠杆菌单菌落进行PCR扩增、酶切来验证是否构建成功，将构建成功的重组酵母表达载体转入到R5421中具体步骤如下：用接菌环取保存的R5421酵母菌划线于固体培养基YPDA上，28°C培养12h;挑取R5421酵母单菌落于Ep管中，加ImLYPDA培养液涡旋;将上述菌液全部转入装有YPDA培养液的三角瓶中，于30°C，250rpm摇菌至0D_=1·2，16h;按1:10转接，摇至OD6qq=1·0〜1·2;于28°C，IOOOrpm离心5min集菌，用12体积的灭菌超纯水重悬；于28°C，IOOOrpm离心5miη集菌，吸干上清;依次加入下列成分每5mL原始菌液）：[0034][0035]涡旋Imin，使转化体系完全混匀；放于30°C的水浴中温育30min;再放入42°C的水浴中热击28min，冰上冷却IOmin;7000rpm离心15s，弃上清；用ImL的无菌水轻轻重悬沉淀；取200yL转化混合物铺于营养缺陷型平板上;30°C培养3天。提取酵母质粒并鉴定结果[0036]挑取酵母单克隆于加KCl的液体培养基中，培养至饱和；[0037]收集菌液1.5mL，离心，弃上清，用200yL酵母提取液重悬沉淀；[0038]加入0.45mm的无菌玻璃珠Promega刚好低于液面，祸旋Imin，加入200yL的酸氯仿，再涡旋lmin，离心取上清至另一新离心管中，再加入200yL的酚氯仿，离心取上清；用60yL3M的NaAc和400yL无水乙醇，于-20°C沉淀DNA，30min。离心，干燥，将质粒溶于15yL无菌水，进行PCR鉴定。[0039]挑取鉴定过的酵母单菌落在营养缺陷平板上划线，30°C培养3天;用牙签在营养缺陷平板上蘸取少量菌体于2ml营养缺陷液中培养12h;8000rpm离心Imin收集菌体;弃上清，用Iml双蒸水悬浮菌体，8000rpm离心Imin;弃上清，用Iml双蒸水重悬浮，调0D6QQ为0.8;将未稀释菌液及分别稀释10倍、100倍后的菌液，分别取5uL在钾离子浓度为0，2mM的培养基上，30°C培养3天观察结果。[0040]结果如图IB所示，在钾离子浓度为OmM培养基上，阴性对照P416几乎不生长，本发明钾转运体和阳性对照HKTl均可以生长，且生长明显比P416好。随着稀释倍数的增加，钾转运体及阳性对照HKTl仍然可以生长。[0041]上述结果证明，本发明所述的HKTl基因具有钾吸收和转运功能。[0042]实施例3[0043]使用农杆菌介导法将HKTl基因转入到烟草中使其超量表达得到转基因烟草Tl代，在得到转基因烟草Tl代后，使转基因烟草Tl自然繁殖得到转基因烟草T2代，使用火焰光度计法对3个株系超量表达该基因的T2代转基因烟草叶片进行钾含量测定，结果表明3个转基因株系钾质量含量分别是1.6%，1.2%，1.9%，而同一条件下非转基因烟草叶片中钾离子的质量含量是0.84%，3个株系转基因材料的钾含量明显高于非转基因材料，说明该基因超量表达后能够促进烟草对钾的吸收。[0044]由以上实施例可知，本发明所述的HKTl基因具有促进钾吸收和转运功能。[0045]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。[0046][0047][0048]

权利要求：1.一种烟草HKTl基因，其特征在于，所述HKTl基因的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示。2.权利要求1所述的烟草HKTl基因的制备方法，包括以下步骤：设计PCR扩增引物，所述的PCR扩增引物包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的核苷酸序列为：5’-ATGATCCTTTCATTGTTAGG-3’，所述的反向引物的核苷酸序列为5’-TTATAATACTTTCCAGCCC-3’；提取烟草细胞总RNA;合成烟草细胞cDNA;以所述烟草细胞cDNA为模板进行HKTl基因的PCR扩增，得到目的片段，测序后得到HKTl基因。3.根据权利要求2所述的烟草HKTl基因的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增引物的设计是以NCBIReferenceSequence:XM_009601690.1为参考序列，使用软件primer5设计得到的，所述乂]«_009601690.1的核苷酸序列如36910如.2所示。4.根据权利要求2所述的烟草HKTl基因的制备方法，其特征在于，所述的PCR扩增的体系为20yL体系，包括PremiXExTaqIOyL，1ΟμΜ的正向引物0.5yL，1ΟμΜ的反向引物0.5yL，烟草细胞cDNAIyL，CldH2O8yL。5.根据权利要求2或4所述的烟草HKTl基因的制备方法，其特征在于，所述的PCR扩增的反应程序为:95°C预变性5min;95°C变性3〇8;55°：退火3〇8;72°：延伸21^11;35个循环。6.根据权利要求2所述的烟草HKTl基因的制备方法，其特征在于，所述的目的片段在测序之前还包括:将所述目的片段导入大肠杆菌DH5a感受态细胞中进行菌落PCR验证，验证为阳性克隆后进彳丁测序。7.根据权利要求6所述的烟草HKTl基因的制备方法，其特征在于，所述菌落PCR验证使用的正向引物的核苷酸序列为:5’-ATGATCCTTTCATTGTTAGG-3’，所述菌落PCR验证使用的反向引物的核苷酸序列为:5’-TTATAATACTTTCCAGCCC-3’。8.根据权利要求6所述的烟草HKTl基因的制备方法，其特征在于，所述菌落PCR验证的体系为IOyL，包括PremiXExTaq5yL，1ΟμΜ的正向引物0.5yL，1ΟμΜ的反向引物0.5yL，CldH2O4yL〇9.权利要求1所述的烟草HKTl基因在促进烟草植株钾离子吸收和转运方面的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述的烟草HKTl基因转入到烟草植株中，使HKTl基因超量表达以提高烟草植株的烟叶中钾离子的含量。

百度查询： 贵州省烟草科学研究院 一种烟草HKT1基因及其制备方法和应用

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