申请/专利权人：四川天艺生态园林集团股份有限公司

申请日：2018-01-26

公开（公告）日：2020-10-23

公开（公告）号：CN108034664B

主分类号：C12N15/52(20060101)

分类号：C12N15/52(20060101);C12N9/00(20060101);C12N15/10(20060101);C12N15/82(20060101);A01H5/12(20180101);A01H6/56(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.23#授权;2018.06.08#实质审查的生效;2018.05.15#公开

摘要：本发明公开了一种白花虎眼万年青QtDCAF8基因及应用，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；该基因能够应用在植物珠芽和叶片再生发育机理以及培育叶形奇特的花卉植物新品种分子育种中，具有很好的应用前景。

主权项：1.一种白花虎眼万年青QtDCAF8基因，其特征在于，所述的白花虎眼万年青QtDCAF8基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

全文数据：一种白花虎眼万年青QtDCAF8基因及应用技术领域[0001]本发明属于植物基因工程技术领域，具体地说，涉及一种白花虎眼万年青QtDCAF8基因及应用。背景技术[0002]鳞茎球根花卉是指其植株地下部分的茎或根变态、膨大并贮藏大量养分的一类多年生草本植物，包括百合、郁金香、风信子和番红花等，多数均具有较高的观赏、药用、经济和生态价值，具有抗逆性强、适应范围广、易栽培管理等优点，但是其繁殖方式绝大多数均为为“老球上长新球”，形成对老球的严重依赖，并且品种优良性状难以持续保持下来，繁殖系数低、再生困难和种球生活力不断退化等问题已经成为制约球根花卉发展的瓶颈问题。而且在繁殖过程中叶片等植株的其他部位被白白扔掉，影响环境卫生，对原有植株损伤也很大，妨碍后续生长。[0003]白花虎眼万年青Ornithogalumthyrsoides是百合科虎眼万年青属多年生鳞莖球根花卉，具有生命力旺盛、适应范围广、繁殖能力强、易栽培等优点，特别是表现出很强的再生能力，能够以叶片上形成多个珠芽的方式进行高效再生，即“叶上珠芽”，表现出繁殖系数高、保持生活力不退化、操作简洁高效、充分利用叶片等材料、对原有植株损伤少等显著优点，为解决鳞茎球根花卉困难提供了新的思路和途径。[0004]白花虎眼万年青叶上珠芽的机制对于科研和生产均具有较高的价值和意义，亟需深入研宄;而且虎眼万年青属植物的叶片和鳞茎等器官形成的分子机制尚未见到报道。[0005]DCAFDDBl-CUL4AssociatedFactor是以CUL4CULLIN4蛋白为骨架的E3泛素一蛋白连接酶复合体，这类复合体通过一个共同的衔接蛋白DDB1UV-DamagedDNABindingProtein1连接不同的底物识别亚基DCAF，介导各自特定的蛋白底物的降解，从而参与调控生物体的多种生物学途径。DCAF基因是最早在人类和哺乳动物中发现的，参与了DNA的损伤修复、基因的转录、基因组的复制、组蛋白的甲基化等多种生命过程，并被认为是动物干细胞崭新的调控者，从翻译后水平调控动物干细胞的动态平衡。而在植物中研宄很晚也很少，仅在拟南芥、水稻和番茄中见到报道，在拟南芥中参与了多种植物发育过程，在水稻中与败育和秕谷有关，在番茄中研究发现DCAF中的DDB1基因发生突变会产生高色素突变，DCAF基因的研究在百合科及其他植物中尚未见到报道。发明内容[0006]有鉴于此，本发明提供了一种白花虎眼万年青QtDCAF8基因及应用。[0007]为了解决上述技术问题，本发明公开了一种白花虎眼万年青QtDCAF8基因，包括a或b任一所述的核苷酸序列：[0008]aSEQIDNO.1所示的核苷酸序列；[0009]bSEQIDNO.1所示的核苷酸序列经替换，缺失或添加碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。[0010」本发明还公开了—种上述的白花虎眼万年青QtDCAF8基因编码的蛋白。[0011]进一步地，其氨基酸如SEQIDNO.2所示。[0012]本发明还公开了一种含上述的核苷酸序列的白花虎眼万年青QtDCAF8基因表达载体。[0013]本发明还公开了一种含上述的表达载体的宿主细胞。[00M]本发明还公开了一种QtDCAFS基因的制备方法，包括以下步骤：[0015]步骤1、提取白花虎眼万年青RNA，并反转录获得cDNA模板；[0016]步骤2、对cDNA模板进行PCR扩增，获得QtDCAF8基因编码区PCR产物;所述PCR扩增的引物包括QtDCAF8F和QtDCAF8R，其核苷酸序列分别如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示；[0017]步骤3、对QtDCAF8基因编码区PCR产物进行连接反应，将其转入大肠杆菌感受态中，涂布平板，37°C倒置培养后挑取单克隆进行PCR鉴定及测序，得到核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的QtDCAFS基因，其所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。[0018]本发明还公开了一种上述的表达载体的构建方法，该方法中用到的无缝连接引物包括\61〇1〇0八「8「和卟111〇1〇0八「81?;其核苷酸序列分别如5£〇10购.5和8£〇10购.6所[0019]本发明还公开了一种上述的白花虎眼万年青QtDCAF8基因在植物珠芽和叶片再生发育机理以及培育叶形奇特的花卉植物新品种分子育种中的应用。[0020]进一步地，所述植物为鳞茎球根花卉。[0021]进一步地，所述鳞茎球根花卉为白花虎眼万年青。[0022]与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：[0023]本发明是建立在稳定成熟的白花虎眼万年青叶上珠芽高效再生体系及其转录组分析的基础上的，克隆了E3泛素与DDB1和CUL4所组成的DDB1-CUL4ASSOCIATEDFACT0R8DCAF8在白花虎眼万年青中的同源基因QtDCAF8,并将其置于泛素启动子Ubiquitin下构建了组成型的植物表达载体，将其导入模式植物烟草中，发现转基因烟草的叶片和植株的生长发育产生了明显的变化，出现了叶片浅裂、叶脉紊乱等表型，是通过对干细胞的调控来实现的，是调控植物干细胞活性的重要功能基因，应用于植物珠芽和叶片等器官再生发育机理的研究，以及培育叶形奇特的花卉新品种等植物分子育种等研究中，具有很好的应用前景。[0024]当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明[0025]此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：[0026]图1是本发明白花虎眼万年青叶上珠芽总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳图；其中，a和b均为总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳条带；[0027]图2是本发明白花虎眼万年青QtDCAF8基因完整编码区经PCR扩增后PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图；其中，1-4是扩增基因的电泳条带，5是分子量MarkerZ即DL2000plus；[0028]图3是本发明pUBGFP+QtDCAF8植物表达载体构建过程示意图；[0029]图4是本发明pUBGFP+QtDCAFS植物表达载体经双酶切检测的1%琼脂糖凝胶电泳图；[0030]图5是本发明转基因烟草的抗性不定芽；[0031]图6是本发明转基因烟草节间明显缩短的照片；[0032]图7是本发明转基因烟草的叶片形状发生了明显变化，其中，a代表叶片歪斜且叶脉不明显，b代表叶片极其不对称且边缘出现突起;c代表叶片主脉隆起且边缘波浪状，d代表叶片成戟形，e代表叶片部分缺失，f代表叶片主脉变粗且边缘有棱角。具体实施方式[0033]以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。[0034]实施例1制备QtDCAF8基因：[0035]在经过灭菌的超净工作台上剪切白花虎眼万年青无菌组培苗的叶片并转接到含有细胞分裂素的培养基上，经过20〜30天后，叶片表面逐渐长出多个绿色的小球，叶上珠芽开始形成，以白花虎眼万年青叶上珠芽为材料，提取RNA，并反转录成cDNA，设计相应引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，与pMDl9_T载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。挑取阳性克隆进行质粒抽提，根据pUBGFP植物表达载体的序列信息设计两条无缝融合的引物并对阳性质粒采用高保真酶进行PCR扩增，与进过线性化处理的pUBGFP植物表达载体进行无缝融合来进行植物表达载体构建，将构建好的植物表达载体用冻融法导入根瘤农杆菌LBA4404中，用叶盘法对烟草叶片进行侵染，在含有潮霉素的培养基上进行筛选，获得的抗性植株进行PCR鉴定后，观察其表型，并拍照记录。[0036]⑴总RNA提取[0037]在经过灭菌的超净工作台上剪切白花虎眼万年青无菌组培苗的叶片并转接到含有细胞分裂素的培养基上，经过20〜3〇天后，叶片表面逐渐长出多个绿色的小球，叶上珠芽开始形成，以白花虎眼万年青叶上珠芽为材料，采用大连宝生物的总RNA提取试剂盒RNAisoPlus的操作步骤进行RNA的提取，所使用的试剂盒耗材均处理使其无RNA酶。白花虎眼万年青总RNA经过1%琼脂糖电泳检测结果如图i所示，;1和13两个电泳道中均出现了两条清晰明亮的谱带，18S和28S均完整良好，证明获得了较高质量的rnA;经过紫外分光光度计检测，其〇D26〇OD28值为1•90，ODmoOD23。值为2•00，表明RNA质量较好，可用于下一步试验。[0038]RNA提取的具体步骤为：用剪刀将组培玻璃瓶的白花虎眼万年青叶上珠芽剪取下来放到研钵内，加入液氮后研磨，用小勺小心地将匀浆装入已经加入RNAiPlus提取液的^5ml的EP管中，并震荡使得植物匀浆与提取液充分接触混匀，室温静置5分钟，然后在冷冻呙心机上l2〇〇〇g4°C呙心5分钟，将上清液转移至新的1•5mi的ep管中，加入等体积的氯仿，震荡混匀，室温静置5分钟，l2〇〇Og4°C离心15分钟，用移液枪吸取上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，室温静置10分钟，12000g4°C离心10分钟，吸去上清液，用lml的75%乙醇漂洗两次，在超净台上干燥，然后用适量的DEpc水溶解。[0039]2cDNA模板的制备[0040]以所得的RNA为模板，反转录获得CDNA，所使用的是诺唯赞公司的HiScriptnIstStrandCdnaSynthesisKit试剂盒，1反应混合液的制备:在无RNA酶的离心管内依次加入下列试剂：1111^1^1116；1：〇]^〇册23\^〇，总1?祖6111，并加入1^86；1^61册2〇至12111，在？0^仪上加热5分钟，迅速置于冰上骤冷，并在冰上静置2分钟，然后加入10XRTMix2ul和HiScriptIIEnzymeMix2ul轻轻混勾后在PCR仪上，程序为50°C50分钟,85°C5分钟，2然后在上述反应液中加入lul的RNaseH，37°C20分钟以去除DNA污染。[0041]⑶基因完整编码区CDS的克隆[0042]根据白花虎眼万年青叶上珠芽转录组获得的QtDCAF8基因完整编码区序列，设计弓丨物进行PCR扩增，引物如下：[0043][0044]QtDCAF8R:TCAGCTGACGATACAGTCCCCTGGATTTCC，其核苷酸序列如SEQIDN0.4所示；[0045]使用诺唯赞公司PhantaSuper-FidelityDNAPolymerase高保真酶进行基因克隆，25ul反应体系，5Xbufferwith10mMMgS045ul，2_5mMdNTP2ul，正向引物2ul，反向引物2ul，cDNA模板2ul，Super-FidelityDNAPolymerase0.5ul，余量加ddH2〇补足。[0046]PCR反应条件JS-CdminJSt^Osjel^OsJSt^mindStcycleJSriOmind°C?Forever〇[0047]QtDCAF8基因编码区PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，获得了约为1500bp的条带，初步证明该基因已经扩增成功。[0048]在紫外灯下，用解剖刀将目的条带的DNA从琼脂糖凝胶上小心切割下来，进行纯化回收，采用宝生物TakarapMD-TVector载体系统进行连接反应，反应体系如下：5ulLigationBuffer，lulpMD_TVector，4ulPCR纯化产物，ddH2〇补足至10ul，混勾，16度过夜后，将其转入大肠杆菌感受态中，涂布平板，37°C倒置培养后挑取单克隆进行PCR鉴定及测序；[0049]对获得的阳性克隆进行测序分析，发现QtDCAFS基因编码区长度为1494bp，序列为SEQIDNO.1所示，所编码的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示，包括498个氨基酸的开发阅读框0RF。将测序获得的序列在NCBI上进行Blast比对，查找到其同源序列，采用软件进行其同源序列比对，发现与海枣、油棕等QtDCAFS基因同源性较高。[0050]本发明运用了分子生物学和生物信息学的先进技术，并结合转录组分析，所筛选并克隆的QtDCAF8基因在植物中研宄很少，仅仅在拟南芥和水稻中进行过初步研宄，在虎眼万年青属植物及其他植物中尚未见到报道，并且QtDCAFS基因功能强大，对于研究白花虎眼万年青叶上珠芽及其他器官发育的分子机制以及对于其他鳞茎球根花卉和困难再生的植物解决困难再生的问题提供了有价值的目的基因；本发明的材料特殊“叶上珠芽”，立意新颖，方法先进，对于科研和生产均具有较高的价值和意义，研究关键基因QtDCAI^S基因从而来探讨叶上珠芽等器官的发育机制，用于调控叶片发育及赋予其他困难再生植物的叶片具有再生能力，应用前景广阔。[0051]实施例2基因功能验证[0052]首先构建白花虎眼万年青QtDCAF8基因植物表达载体，转入野生型烟草中，进行真核细胞表达及转基因烟草植株的表型观察、鉴定与分析[0053]一QtDCAFS基因的组成型植物表达载体的构建[0054]1.将QtDCAF8基因的0RF克隆至pUBGFP载体并置于泛素启动子的控制下；[0055]2•根据上述白花虎眼万年青QtDCAF8基因cDNA序列和pUBGFP载体的Xbal和Kpnl各个酶切位点旁15〜20个碱基设计无缝连接引物，序列如下：[0056]XbaIQtDCAF8F:gttgatgtgattacagtctagaATGGCGAGGGTTGGAAAGAAAGGGAAG，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示;斜体且划线部分表示酶切位点；[0057]KpnIQtDCAF8R:atcgatggcgcgcctaggtaccTCAGCTGACGATACAGTCCCC，其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示;斜体且划线部分表示酶切位点；[0058]3•采用XbaIQtDCAF8F和KpnIQtDCAF8R引物对己经获得的白花虎眼万年青cDNA模板进行扩增后回收目的条带，与经过Xbal和Kpnl双酶切处理的线性化pUBGFP载体进行无缝融合连接，并将反应产物转化大肠杆菌，涂布平板，挑取单克隆后摇菌，提取质粒进行双酶切检测。[0059]4.采用宝生物Xbal和Kpnl快切酶双酶切，双酶切反应体系如下：：2UlbUffer，0.5ulXbaI，0.5ulKpnI，ddH2〇upto20ul。[0060]在PCR仪上进行37度，20分钟，1%琼脂糖凝胶电泳检测。[0061]构建得到的pUBGFP+QtDCAF8植物表达载体如图3所示，双酶切结果如图4所示，切下来的QtDCAF8基因和pUBGFP植物表达载体条带符合目的片段大小，表示pUBGFP+QtDCAF8植物表达载体构建成功。[0062]本发明采用了无缝融合植物表达载体构建技术与T4DNA连接的植物表达载体构建方法相比，只需一次扩增和转化即可完成，无需连接到T载体上及两次转化，节约了时间和试剂;并采用了快切酶和双酶切的方法，节约了时间，效率也明显提高。[0063]二叶盘法转化烟草[0064]1•将pUBGFP+QtDCAFS植物表达载体采用冻融法转入根瘤农杆菌LBA4404感受态中，涂布平板；[0065]2•在无菌条件下挑取平板上的阳性菌落，接种于YEB液体培养基中（Sm+，Kan+，28度，200rpm振荡培养24〜36小时；[0066]3•在离心机上4000g离心5min后，丢弃上清，用12MS液体培养基悬浮菌丝体并稀释，使得菌液的浓度0D600值为0.6左右；[0067]4.选取生长健壮的烟草组培苗的无菌叶片，去其主脉，剪成〖平方厘米左右的小叶片；[0068]5•将上述小叶片放入制备好的菌液中，浸泡5分钟，在无菌滤纸上吸干菌液；[0069]6•把经侵染的叶片接种于MS培养基中，28度黑暗条件下共培养2〜3天；[0070]7•将经过共培养的烟草叶片转接到抑菌培养基MS+6BA2.〇mgL+Carb250mgL上，在25度左右光照下培养，15〜20天左右，以去除根瘤农杆菌；[0071]8•将上述烟草接种于筛选培养基上MS+6BA2.0mgL+Hyg50mgL上，进行抗性不定芽的筛选，[0072]9.将筛选出的不定芽切下转接到生根培养基（12MS+NAA1.OmgL上进行生根培养，一周后逐渐开始生根，并进行观察、记录和拍照，如图5-图7所示。[0073]三转tDCAF8基因烟草表型观察[0074]1•如图5所示，说明经过潮霉素筛选己经获得烟草的抗性不定芽。[0075]2•如图6所示，转基因烟草的节间明显缩短说明细胞分裂素与_CAF8基因互相作用，细胞为朱系阮微沾UtDCAF8基因的表达，而QtDCAF8基因的表达能够促细胞分裂素含量提咼，从而改变了细胞分裂素与生长素的比例，使得节间缩短。、[0076]3•如图了所不’转基因烟草叶片出现了缺失、歪斜、叶脉紊乱、戟形、'叶缘裂片等多种表型，转基因烟草的叶片形状和叶脉发生了明显的变化，QtDCAF8基因能够改变叶片^激素和影响叶脉的发育从而对转基因烟草的叶片产生影响。[0077]上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

权利要求：1.一种白花虎眼万年青叭DCAF8基因，其特征在于，包括a或b任一所述的核苷酸序列：_aSEQIDNO.1所示的核苷酸序列；bSEQIDNO.1所示的核苷酸序列经替换，缺失或添加碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。2.—种权利要求1所述的白花虎眼万年青的DCAFS基因编码的蛋白。3.根据权利要求2所述的蛋白，其特征在于，其氨基酸如SEQIDNO.2所示。4.一种含有权利要求1所述的核苷酸序列的白花虎眼万年青QtDCAF8基因表达载体。5.—种含有权利要求4所述的表达载体的宿主细胞。6.—种QtDCAFS基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、提取白花虎眼万年青RNA，并反转录获得cDNA模板；步骤2、对cDNA模板进行PCR扩增，获得QtDCAF8基因编码区PCR产物;所述PCR扩增的引物包括QtDCAF8F和QtDCAF8R，其核苷酸序列分别如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示；步骤3、对QtDCAF8基因编码区PCR产物进行连接反应，将其转入大肠杆菌感受态中，涂布平板，37°C倒置培养后挑取单克隆进行PCR鉴定及测序，得到核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的QtDCAFS基因，其所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。7.—种权利要求4所述的表达载体的构建方法，其特征在于，该方法中用到的无缝连接引物包括XbaIQtDCAF8F和KpnIQtDCAF8R;其核苷酸序列分别如SEQIDN0.5和SEQIDN0.6所示。8.权利要求1所述的白花虎眼万年青QtDCAF8基因在植物珠芽和叶片再生发育机理以及培育叶形奇特的花卉植物新品种分子育种中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物为鳞茎球根花卉。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述鳞茎球根花卉为白花虎眼万年青。

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