申请/专利权人：河南省农业科学院

申请日：2017-07-04

公开（公告）日：2020-11-10

公开（公告）号：CN107236810B

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12N15/11(20060101);A01H1/02(20060101);A01H1/04(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.06.14#未缴年费专利权终止;2017.11.07#实质审查的生效;2017.10.10#公开

摘要：本发明涉及一种玉米雄性核不育基因、其分子标记及应用。本发明包括IDP797245和IDP30786两个分子标记，其PCR扩增的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO.1至SEQIDNO.4所示，且其与玉米性状连锁，能够准确定位和标记玉米雄性核不育基因ms‑5，其在植株的鉴定、品种的遗传背景、筛选目标单株，在品种的改良和产量构成以及克隆性分化控制基因等方面有重要的应用意义；本发明雄性不育基因ms‑5是一个新的雄性不育基因，以其进行杂交制种时，可以免去人工去雄，节约人力，降低种子成本，同时又是提高杂交制种效率、种子纯度，保证制种质量的一条经济有效的途径。

主权项：1.一种用于扩增玉米雄性核不育基因的分子标记的引物，其特征在于，包括以下引物对：IDP30786-U：GATTTCGGTTGGAGGAGT，IDP30786-L：AGGCAGAGGGTGTTTGTG；IDP797245-U：GCCCTCAACGGCTTCCTT，IDP797245-L：CCACGCTGTGCTTACGAC。

全文数据：玉米雄性核不育基因、其分子标记及应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种玉米雄性核不育基因、其分子标记及应用。背景技术[0002]雄性不育是植物中普遍存在的一种生物学现象，也是杂种优势利用的一种途径。植物雄性不育指植物雄蕊发育不正常，不能产生正常花粉、花药并遗传给后代的现象。[0003]植物雄性不育可能是由于内在基因突变引起的，也有可能是外界条件导致的，因此，可以通过不同影响因素来给雄性不育材料进行归类:不可遗传型和可遗传型是雄性不育材料的两大分类，这是Kaul提出的；而后，前人又把雄性不育分为:细胞质不育、细胞核不育、细胞质、核互作不育。植物细胞质雄性不育，质不育基因的Fl不能自交结实，是因为细胞质母体遗传的原因，故不能在制种上利用;细胞质基因不能影响细胞核雄性不育，因其是由核基因控制的，根据育性控制条件，可将细胞核雄性不育分显性核不育和隐性核不育，经过前人的研究不难发现，大部分不育都是有隐性核不育控制;质核互作雄性不育，该类基因由核不育和质不育基因控制，但在生产中利用该雄性不育会易受专一性病原小种的侵染而使杂交玉米存在风险。[0004]分子标记，是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，狭义的分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特性DNA片段。而玉米是重要的粮食作物，也是雄性不育材料是一种非常珍贵的种质资源，对玉米的雄花发育机理研究、遗传育种应用、杂种优势方面都有重要价值。[0005]随着分子标记技术的发展，获得了与玉米性状连锁的分子标记，对鉴定玉米是否有性别决定的基因；对植株的鉴定、品种的遗传背景、筛选目标单株;对品种的改良和广量构成以及克隆性分化控制基因等方面有重要意义。发明内容[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种能够准确定位和标记玉米雄性核不育基因抓-5的分子标记，该分子标记与玉米性状连锁，为鉴定玉米是否有性别决定的基因；对植株的鉴定、品种的遗传背景、筛选目标单株;对品种的改良和产量构成以及克隆性分化控制基因等方面有重要的应用意义。[0007]为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：设计一种玉米雄性核不育基因的分子标记，包括两个分子标记，其PCR扩增的引物对的核苷酸序列分别为（如SEQIDNO.1至SEQIDNO.4所示所示）：IDP797245-L：CCACGCTGTGCTTACGAC〇[0008]鉴定获得了一种玉米雄性核不育基因定位于玉米4号染色体上、且处于IDP797245和IDP30786两个分子标记之间的雄性核不育基因。[0009]所述玉米雄性核不育基因的分子标记或玉米雄性核不育基因Z22S-5在玉米育种中的应用。[0010]利用所述玉米雄性核不育基因的分子标记培育玉米雄性核不育品种的方法，以具有玉米雄性核不育基因抓-5的玉米品种为亲本之一，通过回交、杂交或组织培养的方法培育玉米雄性核不育自交系，在其后代中选择同时具有玉米雄性核不育基因fls-5的所述两个分子标记、并且农艺性状符合栽培需要的植株，重复多次直至获得雄性核不育自交系。[0011]设计一种用于扩增所述玉米雄性核不育基因的分子标记的引物，包括以下引物对：[0012]设计一种玉米雄性核不育基因的分子标记的检测试剂盒，含有所述引物对。[0013]本发明积极有益的技术效果在于：1.本发明的玉米突变体不育基因ms-5表现为完全雄性不育，植株花药不散出，ms-5突变体植株减数分裂正常，小袍子母细胞在细胞壁形成后降解。[0014]2.本发明以ms-5突变体为主要实验材料，通过对ms-5材料的遗传分析和定位，为实现ms-5突变体的分子育种及应用奠定了基础。[0015]3.本发明雄性不育基因ms-5是一个新的雄性不育基因，以其进行杂交制种时，可以免去人工去雄，节约人力，降低种子成本，同时又是提高杂交制种效率、种子纯度，保证制种质量的一条经济有效的途径。[0016]4.本发明分子标记与玉米性状连锁，为鉴定玉米是否有性别决定的基因；其在植株的鉴定、品种的遗传背景、筛选目标单株，在品种的改良和产量构成以及克隆性分化控制基因等方面有重要的应用意义。附图说明[0017]图1为22S-5野生型和突变体的雄花表型比较图；图2为野生型（左和突变体右花粉碘-碘化钾染色对比图；图3为部分在父本和母本间具有多态性的引物电泳条带图；图4为用引物IDP30786进行PCR扩增所得的电泳图谱;其中M为Marker，1为父本，2母本。[0018]图5为引物IDP797245进行PCR扩增所得的电泳图谱；其中M为Marker，1为父本，2母本。[0019]图6为用引物IDP30786进行PCR扩增所得的F2代分离群体中不育单株的电泳图谱；其中1为父本，2母本。[0020]图7为引物IDP797245进行PCR扩增所得的F2代分离群体中不育单株的电泳图谱；其中1为父本，2母本。[0021]图8为玉米雄性核不育基因m-5与分子标记在染色体上的相对位置示意图。具体实施方式[0022]下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。[0023]以下实施例中所涉及的材料与方法的说明（其无特别说明的则均为常规材料与方法：1.玉米雄性不育突变材料:本发明的供试材料是以C7-2、郑58为为自交系的不育株，其表现为:花药体积萎缩为正常植株的三分之一，而且无散粉现象，玉米植株表现为完全雄性不育，把不育系命名为ms-5,将引起雄性不育性状的基因命名为fls-5。[0024]2.玉米叶片DNA提取用于southern杂交的DNA的提取：a在50ml带盖离心管中加入IOml2XCTAB使用前加入2%的β-硫基乙醇缓冲液，在65°C水浴锅中预热。[0025]b取5g左右新鲜叶片，放在预冷的研钵中，加入液氮，迅速研磨成粉状一定要保证样品处在液氮中），之后迅速转入上述缓冲液中，颠倒使其完全混匀再做下一个样品之前要确保上一个样品的充分混合，因为样品与缓冲液未完全混合会导致DNA降解）。[0026]c65°C水浴60min，每IOmin颠倒一次。[0027]d加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1，不断顺时针摇晃20min，以达到充分混匀，放到离心机4°C12000rpm离心15min。[0028]e取上清液，加入等体积的异丙醇放_20°C预冷），轻微摇晃，可见到白色絮状沉淀，于_20°C放置30min以上。[0029]f挑出白色絮状沉淀，倒掉上清液，加5ml70%乙醇冲洗两次。[0030]g加无水乙醇Iml，将沉淀转移至2ml离心管中，倒掉酒精，晾干后加TE1ml。[0031]h每管加入15μ1RNA酶，37。：水浴3〇11^11。[0032]丨）加入等体积苯酚:氯仿：异戊醇（25:24:1，轻微颠倒混匀，4°：12000印111离心IOmin0[0033]j将上清液吸到另一个新的2ml离心管中，重复步骤i两次。[0034]k将上清液吸到另一个新的2ml离心管中，加等体积氯仿:异戊醇24:1，轻微颠倒混匀，4°C12000rpm离心lOmin。[0035]1取上清液，加入2倍体积无水乙醇和10%体积的醋酸钠pH=5.2于-20°C放置30min以上，之后取出挑出白色沉淀。[0036]m用70%乙醇冲洗两次，再用无水乙醇冲洗一次，晾干颜色为透明状），加入50μ1灭菌的超纯水，于_20°C保存备用。[0037]3.PCR反应体系PCR扩增体系的配制如下。[0038]配混合体系成分体积水12μ1上游引物2μ1下游引物2μ1Mix20μ1模版DNA2μ1注：Mix为2XTapPlusMasterMixPCR扩增程序程序温度，反应时间预变性95°C5min变性95°C30s退火56°C30s变性至延伸33个循环延伸72°C50s后延伸72°CIOmin保存4°C。[0039]实施例I玉米雄性不育突变材料的遗传分析玉米fls-5突变材料是在海南三亚加强甜制种田中发现的不育单株，是自然突变而来，同年用株行内可育株做父本与fls-5做姊妹交保种，经过多代姊妹交保种提纯后，以玉米自交系C7-2为父本与组配群体，对Fl后代育性进行分析鉴定，所有植株正常，在F2分离群体中鉴定可育株与不育株，其符合孟德尔分离定律3:1分离比（见表1，故可推断控制该不育性状由一对隐性核不育基因控制。[0040]表IF2群体正常株和突变株分离比例X20.05,1=3.84实施例2ws-S玉米雄性不育突变材料的表型分析fls-5突变植株在植株前期营养生长过程与正常完全可育材料在株型上基本无差异;到了生殖生长时期，可育植株能够正常抽雄，花药能够正常开裂、散粉，花粉与花丝接触可正常结实；与可育株相比，ns-5不育株能正常抽雄，但是不能正常开花，花药颖壳不开裂，花药干瘪不外露，无花粉粒形成（图1。通过雌穗发育的观察发，突变株与正常株的雌穗均可正常结实，说明突变基因不影响雌穗育性。[0041]实施例3:fls-5玉米雄性不育突变材料花粉的碘-碘化钾染色对正常植株花药和突变体植株花药进行碘-碘化钾染色（图2发现，正常株花粉粒经染色后呈黑褐色（图2右），表明正常株花粉育性正常，而在显微镜下，突变体花药无花粉粒存在，无法进行碘-碘化钾染色（图2左），说明突变体花药发育过程中出现异常导致不能正常形成花粉粒。[0042]实施例4fls-5玉米雄性不育突变材料的基因定位1作物群体的构建利用不育系做母本与自交系C7-2杂交，Fl代植株自交得到F2种子，种植F2代得到性状分离群体，选取F2分离群体中鉴定不育株，并剪取幼嫩叶片提取DNA，用于基因的定位。具体构建过程如下：2014年8月，原阳，种植亲本材料，利用C7-2自交系与不育株杂交组配Fl代。[0043]2014年12月，海南，种植fls-5与C7-2组配的Fl代种子，并进行自交，产生F2代群体。[0044]2015年6月，原阳，种植ms-5F2群体，用不育单株，提取DNA进行定位。[0045]2多态性引物的筛选利用现有的全基因组372对SSR引物对fls-5突变体和C7-2进行多态性引物筛选，共筛选出65对在亲本间具有多态性的SSR引物，在玉米的10条染色体上均有覆盖。[0046]在筛选出的65对引物中，挑选电泳结果条带清晰，父母本及Fl间条带差异明显的弓丨物作为基因定位中使用的引物，部分多态性引物电泳条带如图3所示。[0047]3定位群体确定利用600株F2定位群体，其中150个不育株对fls-5基因进行初定位。首先提取不育株和相应亲本的DNA，接下来进行PCR扩增。[0048]4连锁性分析根据不育性状与多态性标记在某条染色体上出现带型偏分离现象，大部分带型与不育亲本带型相同，另外有一小部分是杂合带型，确定标记与不育基因存在连锁关系，将该基因定位到这条染色体上。[0049]5?2s-5基因的初定位PCR产物经过聚丙稀酰胺凝胶电泳之后，读取条带进行基因的连锁分析，通过玉米所有10条染色体的群体多态性引物筛选发现，抓-5基因位于4号染色体上的SSR标记Bnlgl62149:40:10附近，与正常基因分离比例相比母本多，而父本少，说明基因位点靠近亲本基因位点，再发展标记，通过多态性引物筛选发现，基因位于4号染色体上的SSR标记p-umcl775附近，在该群体中出现带型偏分离现象，母本、杂合（123:27，大部分带型与不育亲本基因的带型相同，另外有部分是杂合带型，这表明该标记所在位置可能与突变基因存在连锁关系，而在其它染色体上所有150个不育单株的扩增条带结果均出现不育带型、可育带型以及杂合带型的随机分离，由此可初步确定影响突变材料育性的不育基因位于4号染色体上。[0050]622s-5基因的精细定位将定位群体扩大并在已初定位的染色体上开发更多的多态性标记，确定目标基因所在的染色体区段。对150个不育单株进行DAN扩增，在SSR标记p-umcl775处，存在27个交换单株，在SSR标记p-umcl808处，存在22个交换单株，在SSR标记Bnlg2162处，存在1个交换单株，说明不育基因更接近Bnlg2162,对300个不育单株再进行DNA扩增，在SSR标记P-umc2188处，发现有25不同与SSR标记Bnlg2162上面的交换单株，在标记mmc0321处，发现13个杂合单株，进一步证明该不育基因位于玉米第4号染色体上的标记Bnlg2162和mmc0321之间。[0051]为了进一步精细定位该基因，根据已测序的基因组序列，开发定位标记区间Bnlg2162和mmc032的标记密度，共开发了6对标记，结果找到2个距离目标基因更近在亲本间具有多态性的标记，即本发明标记（如SEQIDNO.1至SEQIDNO.4所示所示），分别为IDP30786图4和IDP797245图5;同时定位群体进一步扩大到4500株F2分离群体中的不育单株）。提取4500个不育单株DNA，对4500个不育单株再进行DNA扩增和凝胶电泳，结果发现:F2分离群体中的4500不育单株中，在标记IDP30786处有4485个不育单株与不育亲本带型一致（图6，仅有15个交换单株;而在标记IDP797245处，在F2分离群体中的4500不育单株中，有4486个不育单株与不育亲本带型一致（图7，并且有不同与标记IDP30786处14个交换单株。该结果说明不育基因ffis-5位于标记IDP30786和标记IDP797245之间；根据玉米数据库http:www.maizegdb·org，标记IDP30786处于第4号染色体185，760Kb附近，而标记IDP797245处于第4号染色体186，526Kb附近;两标记之间的距离约为76.6Kb图8。

权利要求：1.一种玉米雄性核不育基因的分子标记，包括IDP797245和IDP30786两个分子标记，其PCR扩增的引物对的核苷酸序列分别为：IDP30786-U：GATTTCGGTTGGAGGAGT,IDP30786-L：AGGCAGAGGGTGTTTGTG；IDP797245-U:GCCCTCAACGGCTTCCTT，IDP797245-L：CCACGCTGTGCTTACGAC〇2.—种玉米雄性核不育基因，其特征在于，其为位于玉米第4号染色体上、且处于IDP797245和IDP30786两个分子标记之间的雄性核不育基因。3.权利要求1所述玉米雄性核不育基因的分子标记或权利要求2所述玉米雄性核不育基因在玉米育种中的应用。4.利用权利要求1所述玉米雄性核不育基因的分子标记培育玉米雄性核不育品种的方法，其特征在于，以具有玉米雄性核不育基因肥-5的玉米品种为亲本之一，通过回交、杂交或组织培养的方法培育玉米雄性核不育自交系，在其后代中选择同时具有玉米雄性核不育基因肥-5的所述两个分子标记、并且农艺性状符合栽培需要的植株，重复多次直至获得雄性核不育自交系。5.—种用于扩增权利要求1所述玉米雄性核不育基因的分子标记的引物，包括以下引物对：IDP30786-U：GATTTCGGTTGGAGGAGT,IDP30786-L：AGGCAGAGGGTGTTTGTG；IDP797245-U:GCCCTCAACGGCTTCCTT，IDP797245-L：CCACGCTGTGCTTACGAC〇6.—种玉米雄性核不育基因分子标记的检测试剂盒，含有权利要求5所述的引物对。

百度查询： 河南省农业科学院 玉米雄性核不育基因、其分子标记及应用

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