申请/专利权人：湖北工业大学

申请日：2017-06-27

公开（公告）日：2021-01-12

公开（公告）号：CN107177619B

主分类号：C12N15/70(20060101)

分类号：C12N15/70(20060101);C12N15/12(20060101);C12N1/21(20060101);C12N1/04(20060101);C12R1/19(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.01.12#授权;2017.10.20#实质审查的生效;2017.09.19#公开

摘要：本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种棉铃虫甾醇载体蛋白2的保存方法。本发明所设计的棉铃虫甾醇载体蛋白2的保存方法，包括以下步骤：1基因工程菌的构建；2目的蛋白的大量表达；3用药匙每次挖取菌体10～20g放入液氮中，在液氮的快速冷却作用下菌体被冷冻成固态球状的菌球，待所得的菌体被液氮冷冻成若干个菌球后，将所有的菌球置于‑80℃的冰箱保存；4根据需要的蛋白量，每次从‑80℃的冰箱内取出适量数量的菌球，将菌球溶解于缓冲液中，待完全溶化后依次经细胞破碎，蛋白纯化后得到目的蛋白。该保存方法不仅能确保每次试验研究使用的蛋白的含量和活性保持相对一致性，而且省去了每次诱导培养所需的繁琐工序。

主权项：1.一种棉铃虫甾醇载体蛋白2的保存方法，其特征在于：包括以下步骤：1基因工程菌的构建：目的基因为棉铃虫甾醇载体蛋白2基因，所述棉铃虫甾醇载体蛋白2基因序列如SEQIDNo.1的碱基序列所示；载体为PET28a质粒；表达菌株为大肠杆菌BL21；利用基因工程技术得到基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21；2目的蛋白的大量表达：培养PET28a-HaSCP2-BL21基因工程菌10～14L，菌液的菌体密度OD600达到0.5～0.6时利用IPTG诱导PET28a-HaSCP2-BL21基因工程菌胞内表达棉铃虫甾醇载体蛋白2，棉铃虫甾醇载体蛋白2蛋白的表达量达到细胞总蛋白的40％以上后离心收集菌体；3目的蛋白的保存：用药匙每次挖取菌体10～20g放入液氮中，在液氮的快速冷却作用下菌体被冷冻成固态球状的菌球，待所得的菌体被液氮冷冻成若干个菌球后，将所有的菌球置于-80℃的冰箱保存；4目的蛋白的使用：根据需要的蛋白量，每次从-80℃的冰箱内取出适量数量的菌球，将菌球溶解于缓冲液中，待完全溶化后依次经细胞破碎，蛋白纯化后得到目的蛋白；所述步骤1中包括三个过程：A、从棉铃虫五龄幼虫中肠中提取总RNA；B、利用RT-PCR技术扩增棉铃虫甾醇载体蛋白2基因；C、将棉铃虫甾醇载体蛋白2基因在限制性内切酶的作用下插入PET28a质粒中得到表达载体PET28a-HaSCP2，再将表达载体PET28a-HaSCP2转化到大肠杆菌BL21后通过蓝白斑筛选阳性克隆得到基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21；所述过程B中，RT-PCR技术包括反转录过程和PCR过程，首先利用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，然后以cDNA为PCR的模板，进行PCR过程，PCR扩增体系包括引物HaSCP2F-BamHⅠ和HaSCP2R-HindⅢ；HaSCP2F-BamHⅠ碱基序列如SEQIDNo.2所示，HaSCP2R-HindⅢ碱基序列如SEQIDNo.3所示；所述步骤2包括两个过程：A、菌体的活化过程：将步骤1中得到的基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21接种入5mLLB培养基中活化培养，当LB培养基OD600为0.5时，加入终浓度1mMIPTG进行诱导培养，利用SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白诱导表达量；B、大量诱导表达过程：当HaSCP-2蛋白表达量占到细胞总蛋白的40％以上时，将活化后的菌体接种于10～14LLB培养基中培养，当培养基OD600为0.5时，加入终浓度1mMIPTG进行大量诱导培养，棉铃虫甾醇载体蛋白2蛋白的表达量达到细胞总蛋白的40％以上后离心收集菌体。

全文数据：棉铃虫甾醇载体蛋白2的保存方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种棉铃虫留醇载体蛋白2的保存方法。背景技术[0002]棉铃虫是常见的农业害虫，危害100多种农业作物，对多种化学杀虫剂甚至Bt都产生了较强的抗药性，因此迫切需要开发环境友好型高效新型杀虫剂。研究者在开发棉铃虫生物杀虫剂时，选择以棉铃虫留醇载体蛋白2HaSCP-2为靶标位点，例如，“棉铃虫留醇载体蛋白2HaSCP-2的克隆表达及功能研究，杜馨，华中师范大学，2012”中提及的HaSCP-2的研究，在整个研究过程中（一般5〜10年会多次用到HaSCP-2蛋白，由于HaSCP-2蛋白从菌体内提取出来后在外界的保存时间较短，一般在4°C的环境中可保存一周，于-80°C的环境中可保存一个月。因此，一般实验工作者会根据所需HaSCP-2蛋白的量来诱导培养工程菌，这种做法的缺点是:每次需要HaSCP-2蛋白的时候都要重新诱导培养工程菌，一次诱导培养的周期一般是2〜3天，费时费力；另一方面，HaSCP-2蛋白表达的不稳定，由于菌株的退化以及每次操作的误差会导致每次诱导表达得到的HaSCP-2蛋白存在着较大的差异，在实验室内经常会出现，第一次表达得到的HaSCP-2蛋白的浓度和活性都符合要求，而第二次对基因工程菌诱导表达后得到的HaSCP-2蛋白的含量和活性却不符合要求。发明内容[0003]为解决以上问题，本发明的目的是提供一种棉铃虫留醇载体蛋白2的保存方法，该保存方法不仅能确保每次试验研究使用的棉铃虫留醇载体蛋白2的含量和活性保持相对一致性，而且省去了每次诱导培养所需的繁琐工序。[0004]为实现上述目的，本发明所设计的棉铃虫留醇载体蛋白2的保存方法，包括以下步骤：[0005]1基因工程菌的构建：目的基因为棉铃虫留醇载体蛋白2基因，所述棉铃虫甾醇载体蛋白2基因序列如SEQIDNo.1的碱基序列所示;载体为PET28a质粒;表达菌株为大肠杆菌BL21;利用基因工程技术得到基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21;[0006]2目的蛋白的大量表达:培养PET28a-HaSCP2-BL21基因工程菌10〜14L，菌液的菌体密度OD6qq达到0.5〜0.6时利用IPTG诱导PET28a-HaSCP2-BL21基因工程菌胞内表达棉铃虫留醇载体蛋白2,棉铃虫留醇载体蛋白2蛋白的表达量达到细胞总蛋白的40%以上后离心收集菌体；[0007]3目的蛋白的保存：用药匙每次挖取菌体10〜20g放入液氮中，在液氮的快速冷却作用下菌体被冷冻成固态球状的菌球，待所得的菌体被液氮冷冻成若干个菌球后，将所有的菌球置于_80°C的冰箱保存；[0008]4目的蛋白的使用：根据需要的蛋白量，每次从-80°C的冰箱内取出适量数量的菌球，将菌球溶解于缓冲液中，待完全溶化后依次经细胞破碎，蛋白纯化后得到目的蛋白。[0009]作为优选方案，所述步骤（1中包括三个过程:A、从棉铃虫五龄幼虫中肠中提取总RNA;B、利用RT-PCR技术扩增棉铃虫留醇载体蛋白2基因；C、将棉铃虫留醇载体蛋白2基因在限制性内切酶的作用下插入PET28a质粒中得到表达载体TOT28a-HaSCP2,再将表达载体PET28a-HaSCP2转化到大肠杆菌BL21后通过蓝白斑筛选阳性克隆得到基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21〇[0010]作为优选方案，所述过程B中，RT-PCR技术包括反转录过程和PCR过程，首先利用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，然后以cDNA为PCR的模板，进行PCR过程，PCR扩增体系包括引物HaSCP2F-BamHI和HaSCP2R-HindIΠ;HaSCP2F-BamHI碱基序列如SEQIDNo·2所示，HaSCP2R-HindIΠ碱基序列如SEQIDNo.3所示。[0011]作为优选方案，所述步骤2包括两个过程:A、菌体的活化过程:将步骤⑴中得到的基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21接种入5mLLB培养基中活化培养，当LB培养基OD6Q0为0.5时，加入终浓度ImMIPTG进行诱导培养，利用SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白诱导表达量;B、大量诱导表达过程：当HaSCP-2蛋白表达量占到细胞总蛋白的40%以上时，将活化后的菌体接种于10〜14LLB培养基中培养，当培养基OD6qq为0.5时，加入终浓度ImMIPTG进行大量诱导培养，棉铃虫留醇载体蛋白2蛋白的表达量达到细胞总蛋白的40%以上后离心收集菌体。[0012]本发明的优点在于:本发明利用常规的基因工程技术得到所需的基因工程菌，然后对基因工程菌进行大量的诱导培养，满足至少两年内对该蛋白的需求量;通过用液氮将菌体冷冻成菌球，一方面，通过液氮将菌体迅速冷却，能迅速停止菌体的代谢活动，另一方面，冷冻成若干个菌球方便每次拿取适量的菌球。通过本发明的HaSCP-2蛋白的保存方法能确保每次试验研究使用的HaSCP-2蛋白的含量和活性保持相对一致性，而且省去了每次诱导培养所需的繁琐工序，解决了一直困扰试验研究者的HaSCP-2蛋白的长期使用和保存的问题。具体实施方式[0013]由于表达得到的HaSCP-2蛋白在外界保存的时间较短，因此对于实验研究使用的HaSCP-2蛋白，研究者一直采用按需制备的原则，即每次按照所需蛋白的量来诱导培养基因工程菌，这种做法不仅较为繁琐而且由于菌株的退化以及每次操作的误差会导致每次诱导表达得到的HaSCP-2蛋白存在着较大的差异，给试验研究者带来许多麻烦，研究者一直渴望寻求一种可长期供试验研究使用的HaSCP-2蛋白的保存方法，但是一直未能解决。本发明的HaSCP-2蛋白保存方法以保存表达HaSCP-2蛋白的基因工程菌为设计思路，通过大量诱导培养基因工程菌且利用液氮快速冷冻基因工程菌来达到目的。以下将通过具体的实施例来对本发明的HaSCP-2保存方法的优选方式进行详细地说明。[00M]实施例1[0015]基因工程菌PET28a-HaSCP2_BL21的制备[0016]A、从棉铃虫五龄幼虫中肠中提取总RNA:[0017]解剖五龄棉铃虫幼虫取出中肠，以25〜50mg500yl的比例置于冰冷TRIzol试剂中提取幼虫中肠总RNA。[0018]B、利用RT-PCR技术扩增棉铃虫甾醇载体蛋白2基因：[0019]首先利用promega反转录试剂盒将步骤A中幼虫中肠总RNA进行反转录得到cDNA。[0020]然后以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增体系如表1所示：[0021]PCR扩增的反应程序如表2所示：[0022]PCR扩增结束后即得到目的HaSCP-2基因，HaSCP-2基因的序列如序列表中的SEQIDNo.1所示。[0023]表1[0025]表2[0026][0027]其中，引物HaSCP2F-BamHI和HaSCP2R-Hindm的碱基序列分别为5’-CAggatccATGTACCGCAAAGGATTC-3’和[0028]5’-AGaagcttTTACAGTTTGGAACGAATAGATTCG-3’；[0029]C、获取基因工程菌[0030]利用限制性内切酶为BamHI和Hindm分别酶切目的HaSCP-2基因和PET28a载体质粒，在连接酶的作用下连接HaSCP-2基因和PET28a载体质粒得到表达载体PET28a-HaSCP2，再将表达载体PET28a-HaSCP2转化到大肠杆菌BL21通过蓝白斑筛选阳性克隆，阳性克隆经测序验证其正确性后即得基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21。[0031]基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21的详细构建方法参考论文“棉铃虫留醇载体蛋白2HaSCP-2的克隆表达及功能研究，杜馨，华中师范大学，2012”其中对于基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21的构建做了详尽的说明。[0032]实施例2[0033]目的蛋白的大量表达[0034]1活化:PET28a-HaSCP2-BL21基因工程菌的阳性克隆首先接种于5mLLB培养基中于37°C恒温震荡培养，当培养基OD6qq为0.5时，加入终浓度ImMIPTG于37°C恒温震荡培养2小时后室温下震荡培养过夜，利用SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白诱导表达量。[0035]2大量诱导表达：当HaSCP-2蛋白表达量占到细胞总蛋白的40%以上时，将活化后的菌体接种于12LLB培养基中，于37°C恒温震荡培养，当培养基OD6qq为0.5时，加入终浓度ImMIPTG于37°C恒温震荡培养2小时后室温下震荡培养过夜，利用SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白诱导表达量，当HaSCP-2蛋白表达量占到细胞总蛋白的40%以上后在4°C以6000g离心30min收集菌体。[0036]实施例3[0037]目的蛋白的保存和使用[0038]用不锈钢药匙每次挖取菌体15g放入液氮中，在液氮的快速冷却作用下菌体被冷冻成固态球状的菌球，待所得的菌体被液氮冷冻成若干个菌球，取出菌球置于-80°C的冰箱保存;根据需要的蛋白量，每次从-80°C的冰箱内取出适量数量的菌球，将菌球溶解于PBS缓冲液中，待完全溶化后依次经细胞破碎、镍柱纯化后得到目的蛋白。[0039]研究并测定保存在-80°C的冰箱菌球的HaSCP-2蛋白的含量和活性下降的情况:具体方法如下：[0040]2015年3月1日按照以上实施例HaSCP-2蛋白的保存方法得到一批HaSCP-2菌球，并于当日检测HaSCP-2菌球中HaSCP-2蛋白的含量与活性。一个月后从-80°C的冰箱中取出HaSCP-2菌球检测HaSCP-2蛋白的含量与活性，并且计算相对于2015年3月1日测定HaSCP-2蛋白的含量与活性的下降百分比。二个月、三个月、六个月、九个月、十二个月、十五个月、十八个月、二十个月、二十四个月后进行相同的操作并做计算。具体结果见表3:[0041]表3[0043]从表3中可以看出，将HaSCP-2菌球放置于-80°C的冰箱保存了2年，其蛋白的含量与活性分别下降了15.2%和16.1%，均在允许蛋白下降水平内。因此，利用本发明的HaSCP-2蛋白制备和保存方法至少可将HaSCP-2蛋白保存两年。[0044]以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

权利要求：1.一种棉铃虫留醇载体蛋白2的保存方法，其特征在于:包括以下步骤：1基因工程菌的构建：目的基因为棉铃虫留醇载体蛋白2基因，所述棉铃虫留醇载体蛋白2基因序列如SEQIDNo.1的碱基序列所示;载体为PET28a质粒;表达菌株为大肠杆菌BL21;利用基因工程技术得到基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21;2目的蛋白的大量表达:培养PET28a-HaSCP2-BL21基因工程菌10〜14L，菌液的菌体密度OD6X达到0.5〜0.6时利用IPTG诱导PET28a-HaSCP2-BL21基因工程菌胞内表达棉铃虫甾醇载体蛋白2,棉铃虫甾醇载体蛋白2蛋白的表达量达到细胞总蛋白的40%以上后离心收集菌体；3目的蛋白的保存：用药匙每次挖取菌体10〜20g放入液氮中，在液氮的快速冷却作用下菌体被冷冻成固态球状的菌球，待所得的菌体被液氮冷冻成若干个菌球后，将所有的菌球置于-80°C的冰箱保存；⑷目的蛋白的使用:根据需要的蛋白量，每次从-80°C的冰箱内取出适量数量的菌球，将菌球溶解于缓冲液中，待完全溶化后依次经细胞破碎，蛋白纯化后得到目的蛋白。2.根据权利要求1所述的棉铃虫留醇载体蛋白2的保存方法，其特征在于:所述步骤（1中包括三个过程:A、从棉铃虫五龄幼虫中肠中提取总RNA;B、利用RT-PCR技术扩增棉铃虫甾醇载体蛋白2基因；C、将棉铃虫留醇载体蛋白2基因在限制性内切酶的作用下插入PET28a质粒中得到表达载体PET28a-HaSCP2,再将表达载体PET28a-HaSCP2转化到大肠杆菌BL21后通过蓝白斑筛选阳性克隆得到基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21。3.根据权利要求2所述的棉铃虫留醇载体蛋白2的保存方法，其特征在于：所述过程B中，RT-PCR技术包括反转录过程和PCR过程，首先利用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，然后以cDNA为PCR的模板，进行PCR过程，PCR扩增体系包括引物HaSCP2F-BamHI和HaSCP2R-HindIΠ;HaSCP2F-BamHI碱基序列如SEQIDNo.2所示，HaSCP2R-HindIΠ碱基序列如SEQIDNo.3所示。4.根据权利要求1或2或3所述的棉铃虫留醇载体蛋白2的保存方法，其特征在于:所述步骤（2包括两个过程：A、菌体的活化过程：将步骤（1中得到的基因工程菌PET28a-HaSCP2-BL21接种入5mLLB培养基中活化培养，当LB培养基OD6qq为0.5时，加入终浓度ImMIPTG进行诱导培养，利用SDS-PAGE凝胶电泳检测目的蛋白诱导表达量;B、大量诱导表达过程：当HaSCP-2蛋白表达量占到细胞总蛋白的40%以上时，将活化后的菌体接种于10〜14LLB培养基中培养，当培养基OD6qq为0.5时，加入终浓度ImMIPTG进行大量诱导培养，棉铃虫甾醇载体蛋白2蛋白的表达量达到细胞总蛋白的40%以上后离心收集菌体。

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