申请/专利权人：申联生物医药(上海)股份有限公司

申请日：2017-11-27

公开（公告）日：2021-01-12

公开（公告）号：CN109836479B

主分类号：C07K14/09(20060101)

分类号：C07K14/09(20060101);C07K1/16(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.01.12#授权;2019.06.28#实质审查的生效;2019.06.04#公开

摘要：本发明涉及一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，包括以下步骤：用平衡缓冲溶液平衡模拟流动床的色谱层析柱；将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中可同时对色谱层析柱进行抗原样品杂质清洗及样品解吸洗脱，色谱填料的清洗再生及平衡液平衡，在连续解吸洗脱过程中收集纯化后的样品。本发明首次将模拟流动床应用于FMD灭活病毒抗原的分离纯化，可实现连续饱和上样分离操作，大大提高了上样量；且通过多个单体柱连续分离纯化，连续化程度高，大大缩短了分离纯化时间，提高了制备效率，降低了运行成本。且本发明特定的选择刚性填料，使其填料载量即耐压性大幅提高，减少了色谱填料的使用量，延长了模拟流动床中色谱柱的使用寿命。

主权项：1.一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、用平衡缓冲溶液平衡模拟流动床的色谱层析柱；S2、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中可同时对色谱层析柱进行抗原样品杂质清洗及样品解吸洗脱，色谱填料的清洗再生及平衡液平衡，在连续解吸洗脱过程中收集纯化后的样品；所述模拟流动床色谱层析柱中装填的色谱填料为带有疏水或离子型配基的高强度聚合物填料；所述带有疏水或离子型配基的高强度聚合物填料为：以丙烯酸酯、苯乙烯基苯、二乙烯基苯、苯乙烯、二氧化硅刚性琼脂糖、二氧化硅刚性葡聚糖或刚性纤维素中的至少一种为基质，以羟丙基、丙基、苄基、异丙基、苯基、正丁基、叔丁基、丁硫基、戊基、辛烷基、二乙基氨基乙基、磺酸基、季氨基、羧甲基、二乙基氨基丙基中的至少一种为配基的填料。

全文数据：应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法技术领域本发明涉及兽用生物制品制造技术领域，具体涉及一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法。背景技术口蹄疫病毒FMD是一种在偶蹄类动物间传播的具有经济破坏性的病毒疾病。口蹄疫病毒疫苗样品中与刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞有关的主要是完整病毒颗粒，其沉降系数为146S，被认为与口蹄疫疫苗的效率具有平行关系。国际上口蹄疫疫苗生产主要采用悬浮培养技术，培养反应为3000L-8000L之间，后续纯化工艺主要采用包括聚乙二醇沉淀，超滤除杂，双水相萃取等方法。但这些方法均难以获得高纯度的口蹄疫疫苗抗原。近年来工业色谱技术逐渐被应用于口蹄疫灭活病毒抗原的纯化，相继有专利报道采用凝胶过滤的方法来纯化口蹄疫病毒抗原中国发明专利CN102988970B中公开的口蹄疫纯化疫苗及其制备方法和应用、采用离子交换层析系统来纯化口蹄疫病毒抗原中国发明专利CN104818254A中公开的离子交换色谱纯化口蹄疫灭活病毒抗原的方法.、采用疏水作用层析系统来纯化口蹄疫病毒抗原中国发明专利CN104892734A中公开的疏水作用层析提纯口蹄疫灭活病毒抗原的方法。从专利中内容来看，目前其均采用固定床色谱的方法对口蹄疫病毒抗原进行纯化，其纯化步骤为平衡--上样--清洗--洗脱--在线清洗--平衡，然后继续进行单线循环。应用上述色谱方法纯化时往往存在上样量小、填料载量低、单线操作导致纯化工艺时间长样品损失大、废液产生量大及处理费用高等问题。模拟流动床技术是从上世纪60年代发展起来的一门纯化技术，最初只是应用于石油化工产品的分离，90年代法国Seperex将其应用于药物及精细化工领域的分离纯化，近年年来逐渐应用于糖类、同分异构体、手性化合物、生物发酵液的分离纯化，而口蹄疫悬浮培养灭活病毒抗原的分离纯化，目前还未有将模拟流动床技术应用于病毒样品的分离纯化，主要是应用此技术对流动床体内的填料要求很高，需要寻找耐磨损、耐高压、耐酸碱处理的填料，而目前口蹄疫灭活病毒抗原纯化的普通色谱法的填料是基于葡聚糖或琼脂糖基质的填料，其粒径一般为75um、承压性小于0.3MPa，长时间的酸碱处理容易导致官能基团的脱落导致纯化效果差等问题，限制了模拟流动床技术在口蹄疫灭活病毒抗原纯化领域的应用。发明内容针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：本发明提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，包括以下步骤：S1、用平衡缓冲溶液平衡模拟流动床的色谱层析柱；S2、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中可同时对色谱层析柱进行抗原样品杂质清洗及样品解吸洗脱，色谱填料的清洗再生及平衡液平衡，在连续解吸洗脱过程中收集纯化后的样品。优选地，所述S2的具体步骤为：A、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中检测每根色谱层析柱流出液，当检测到第n根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，则将料液分配至第n+1根色谱层析柱内，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得FMD灭活病毒抗原纯化样品；B、当检测到第n+1根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，将料液分配至第n+2根色谱层析柱，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得灭活病毒抗原纯化样品，并清洗再生已洗脱完毕的层析柱；C、以此类推，直至第m+n根色谱柱树脂填料再生结束后，以平衡液平衡再生后的色谱层析柱继续用于吸附FMD灭活病毒抗原样品；D、循环A至C的步骤，直至FMD灭活病毒抗原样品全部纯化完毕；其中，所述n≥1，n+mn，n和m均为整数，n为首次料液分配进入的色谱层析柱数；n+m为系统总的色谱层析柱数。优选地，所述6≦n+m≦24，根据模拟流动床实际运行情况，兼顾上样、洗杂、样品解吸及柱再生过程，所以色谱柱数最少选择为6根；考虑到模拟流动床实际运行过程中的软、硬件控制，所以色谱柱最多选择为24根。优选地，所述模拟流动床色谱层析柱中装填的色谱填料为带有疏水或离子型配基的高强度聚合物填料。优选地，所述带有疏水或离子型配基的高强度聚合物填料为：以丙烯酸酯、苯乙烯基苯、二乙烯基苯、苯乙烯、二氧化硅刚性琼脂糖、二氧化硅刚性葡聚糖或刚性纤维素中的至少一种为基质，以羟丙基、丙基、苄基、异丙基、苯基、正丁基、叔丁基、丁硫基、戊基、辛烷基、二乙基氨基乙基、磺酸基、季氨基、羧甲基、二乙基氨基丙基中的至少一种为配基的填料。优选地，所述带有疏水或离子型配基的高强度聚合物填料为以苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物为基质的填料。更优选地，所述带有疏水或离子型配基的高强度聚合物填料为以苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物为基质、叔丁基或二乙基氨基丙基为配基的填料。优选地，所述带有疏水或离子型配基的高强度聚合物填料的粒径为3um～20um，孔径所述粒径过大，将会降低填料的寿命。优选地，所述色的谱层析柱的长度为10～60cm。优选地，采用疏水型配基的填料，所述的平衡缓冲液为pH7～9，电导率100～300mscm的硫酸铵、硫酸钠或氯化铵缓冲液；采用离子型配基的填料，所述的平衡缓冲液为pH7～9，电导率5～300mscm的硫酸铵、硫酸钠或氯化铵缓冲液；所述的洗涤杂质缓冲液为pH7～9，电导率5～300mscm的硫酸铵、氯化铵缓冲液或电导率5～300mscm硫酸钠缓冲液；所述洗脱采用的洗脱溶液，采用疏水型配基的填料，所述洗脱采用的洗脱溶液为pH7～9，电导率5～300mscm的硫酸铵、硫酸钠或氯化铵缓冲液；采用离子型配基的填料，所述洗脱采用的洗脱溶液为pH7～9，电导率100～300mscm的硫酸铵、硫酸钠或氯化铵缓冲液。所述清洗再生采用的再生清洗液为氢氧化钠溶液、乙醇溶液、甲醇溶液、异丙醇溶液、尿素溶液、中性界面表面活性剂中的至少一种。优选地，所述的氢氧化钠溶液的浓度为0.1-1.0molL；甲醇溶液、乙醇溶液的浓度均为10-40％VV；异丙醇溶液的浓度为10-30％VV；尿素溶液的浓度为3-8molL；中性界面表面活性剂的浓度为0.2-0.3％VV。更优选地，所述的中性界面表面活性剂包括吐温20、吐温80、聚乙二醇辛基苯基醚-100、十二烷基聚乙二醇醚-35中的至少一种。优选地，所述采用的模拟流动床包括多通旋转阀、槽道外置结构、料液分配器、色谱层析柱，所述采用的模拟流动床包括多通旋转阀、料液分配器、槽道外置结构、色谱层析柱；所述多通旋转阀和料液分配器设置在色谱层析柱上方，所述料液分配器设置在多通旋转阀与色谱层析柱之间；所述料液分配器与色谱层析柱连接；所述槽道外置结构设置在色谱层析柱的外侧。所述多通旋转阀可以在层析柱之间按照工艺要求进行切换，料液分配器可以配合多通旋转阀将料液分配至层析柱内，槽道外置结构可以起到固定及密封层析柱。优选地，所述的多通旋转阀可以同时进行上样、洗脱、再生、平衡四个功能区块的轮换使用。优选地，所述的料液分配器至少可以同时为n根色谱柱进行液体输送。所述的色谱层析柱外侧还设置有夹套，可以满足不同温度下的工艺操作的要求。优选地，所述色谱层析柱的层析工艺温度为2-15℃。本发明还提供了一种用于分离纯化FMD灭活病毒抗原的模拟流动床，包括多通旋转阀、料液分配器、槽道外置结构、色谱层析柱；所述多通旋转阀和料液分配器设置在色谱层析柱上方，所述料液分配器设置在多通旋转阀与色谱层析柱之间；所述料液分配器与色谱层析柱连接；所述槽道外置结构设置在色谱层析柱的外侧。所述多通旋转阀和料液分配器位于装置的上部，负责阀的切换及料液的分配；装置下部为槽道外置结构及色谱层析柱，用于固定、密封、调整色谱柱及料液的层析纯化。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：1、本发明首次将模拟流动床应用于FMD灭活病毒抗原的分离纯化，可实现连续饱和上样分离操作，大大提高了上样量；且通过多个单体柱连续分离纯化，连续化程度高，大大缩短了分离纯化时间，提高了制备效率，降低了运行成本。2、本发明特定的选择刚性填料，使其填料载量即耐压性大幅提高，减少了色谱填料的使用量，延长了模拟流动床中色谱柱的使用寿命。3、采用本发明方法分离纯化FMD灭活病毒抗原后，纯度可高达98％，活性抗原回收率为95％。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为本发明的模拟流动床纯化FMD灭活病毒抗原层析柱运行示意图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。本发明提供了一种利用模拟流动床技术搭配刚性介质填料分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，模拟流动性床技术是一种可以用于层析、吸附、离子交换、梯度洗脱等一种连续运行的色谱设备主体，其通过多个单体柱组合，通过模拟移动工艺实现高效、廉价的连续工业化分离纯化。在运行过程中通过料液进出口位置的依次、定时移动实现分离设备的模拟移动，并且料液进出口可任意更换位置，工作压力及流量稳定，柱外死体积极少，这种连续式方式可保证生产连续进行，填料可边失效边再生，并可提高填料层使用的均匀性，较普通工业制备色谱及其它分离设备其质耗低，能耗低，运行成本更低。所述模拟流动床包括多通旋转阀、料液分配器、槽道外置结构、色谱层析柱；所述多通旋转阀和料液分配器设置在色谱层析柱上方，所述料液分配器设置在多通旋转阀与色谱层析柱之间；所述料液分配器与色谱层析柱连接；所述槽道外置结构设置在色谱层析柱的外侧。其运行示意图如图1所示，各色谱层析柱处于不同的处理状态，从而实现了病毒样品同时进行上样、解吸洗脱及层析柱的再生清洗、平衡液平衡操作。所述设备运行过程中可以循环进样，可减少样品过载的损失。同时为了克服模拟流动床色谱法填料磨损较大、系统压力较大，而普通工业色谱的填料由于基质如葡聚糖或琼脂糖类原因无法使用的的问题，本发明筛选出采用带有疏水配基的高强度聚合物的微球作为色谱填料，该类介质具有粒径较小且均一、耐压性能强耐压最大可以达到4Mpa、耐酸碱好、分辨率高等特点，非常适合象FMDV灭活病毒抗原类生物大分子的工业分离纯化工作。在专利中使用了该类填料，由于该类填料粒径较小比表面积增大使得FMDV灭活病毒抗原的载样量较普通工业色谱大幅提高，从而降低了填料使用量。并且由于此类填料耐酸碱性更强使其易于在位清洗，使用寿命也较普通色谱长。实施例1本实施例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，包括以下步骤：S1、用平衡缓冲溶液平衡模拟流动床的色谱层析柱；S2、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中可同时对色谱层析柱进行抗原样品杂质清洗及样品解吸洗脱，色谱填料的清洗再生及平衡液平衡，在连续解吸洗脱过程中收集纯化后的样品。所述S2的具体步骤为：A、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中检测每根色谱层析柱流出液，当检测到第n根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，则将料液分配至第n+1根色谱层析柱内，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得FMD灭活病毒抗原纯化样品；B、当检测到第n+1根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，将料液分配至第n+2根色谱层析柱，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得灭活病毒抗原纯化样品，并清洗再生已洗脱完毕的层析柱；C、以此类推，直至第m+n根色谱柱树脂填料再生结束后，以平衡液平衡再生后的色谱层析柱继续用于吸附FMD灭活病毒抗原样品；C、第n根色谱柱树脂填料再生结束后，以平衡液平衡后继续用于吸附FMD灭活病毒抗原样品，循环S2操作直至FMD灭活病毒抗原样品纯化完毕；所述n＝5，m＝7。所述模拟流动床色谱层析柱中装填的色谱填料为以苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物为基质、叔丁基为配基的填料；填料的粒径为3um，孔径所述色的谱层析柱的长度为10cm。所述的平衡缓冲液为pH7～9，电导率100～300mscm的硫酸铵缓冲液；所述的洗涤杂质缓冲液为pH7～9，电导率100～300mscm的硫酸铵缓冲液；所述洗脱采用的洗脱溶液为pH7～9，电导率5～300mscm的硫酸铵铵缓冲液；所述清洗再生采用的再生清洗液为浓度为0.1-1.0molL的氢氧化钠溶液。所述色谱层析柱层析工艺温度为2-15℃。采用本实施例方法分离纯化后的FMD灭活病毒抗原样品的纯度为98％，活性抗原回收率为95％。采用本实施例方法进行连续监测，对比100次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的色谱柱可大大提高其使用寿命。实施例2本实施例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，包括以下步骤：S1、用平衡缓冲溶液平衡模拟流动床的色谱层析柱；S2、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中可同时对色谱层析柱进行抗原样品杂质清洗及样品解吸洗脱，色谱填料的清洗再生及平衡液平衡，在连续解吸洗脱过程中收集纯化后的样品。所述S2的具体步骤为：A、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中检测每根色谱层析柱流出液，当检测到第n根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，则将料液分配至第n+1根色谱层析柱内，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得FMD灭活病毒抗原纯化样品；B、当检测到第n+1根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，将料液分配至第n+2根色谱层析柱，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得灭活病毒抗原纯化样品，并清洗再生已洗脱完毕的层析柱；C、以此类推，直至第m+n根色谱柱树脂填料再生结束后，以平衡液平衡再生后的色谱层析柱继续用于吸附FMD灭活病毒抗原样品；C、第n根色谱柱树脂填料再生结束后，以平衡液平衡后作为所有n+m根色谱柱后的第1根色谱柱继续用于吸附FMD灭活病毒抗原样品，循环S2操作直至FMD灭活病毒抗原样品纯化完毕；所述n＝2，m＝4。所述模拟流动床色谱层析柱中装填的色谱填料为以苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物为基质、叔丁基为配基的填料；填料的粒径为10um，孔径所述色的谱层析柱的长度为30cm。所述的平衡缓冲液为pH7～9，电导率100～300mscm的硫酸钠缓冲液；所述的洗涤杂质缓冲液为pH7～9，电导率100～300mscm的硫酸钠缓冲液；所述洗脱采用的洗脱溶液为pH7～9，电导率5～300mscm的硫酸钠缓冲液；所述清洗再生采用的再生清洗液为浓度为10-40％VV的乙醇溶液。所述色谱层析柱层析工艺温度为2-15℃。采用本实施例方法分离纯化后的FMD灭活病毒抗原样品的纯度为97％，活性抗原回收率为96％采用本实施例方法进行连续监测，对比80次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的色谱柱可大大提高其使用寿命。实施例3本实施例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，包括以下步骤：S1、用平衡缓冲溶液平衡模拟流动床的色谱层析柱；S2、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中可同时对色谱层析柱进行抗原样品杂质清洗及样品解吸洗脱，色谱填料的清洗再生及平衡液平衡，在连续解吸洗脱过程中收集纯化后的样品。所述S2的具体步骤为：A、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中检测每根色谱层析柱流出液，当检测到第n根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，则将料液分配至第n+1根色谱层析柱内，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得FMD灭活病毒抗原纯化样品；B、当检测到第n+1根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，将料液分配至第n+2根色谱层析柱，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得灭活病毒抗原纯化样品，并清洗再生已洗脱完毕的层析柱；C、以此类推，直至第m+n根色谱柱树脂填料再生结束后，以平衡液平衡再生后的色谱层析柱继续用于吸附FMD灭活病毒抗原样品；C、第n根色谱柱树脂填料再生结束后，以平衡液平衡后作为所有n+m根色谱柱后的第1根色谱柱继续用于吸附FMD灭活病毒抗原样品，循环S2操作直至FMD灭活病毒抗原样品纯化完毕；所述n＝5，m＝7。所述模拟流动床色谱层析柱中装填的色谱填料为以苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物为基质、叔丁基为配基的填料；填料的粒径为20um，孔径所述色的谱层析柱的长度为60cm。所述的平衡缓冲液为pH7～9，电导率100～300mscm的氯化铵缓冲液；所述的洗涤杂质缓冲液为pH7～9，电导率100～300mscm的氯化铵缓冲液；所述洗脱采用的洗脱溶液为pH7～9，电导率5～300mscm的氯化铵缓冲液；所述清洗再生采用的再生清洗液为浓度为0.2-0.3％VV的吐温20。所述色谱层析柱层析工艺温度为2-15℃。采用本实施例方法分离纯化后的FMD灭活病毒抗原样品的纯度为95％，活性抗原回收率为98％采用本实施例方法进行连续监测，对比50次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的色谱柱可大大提高其使用寿命。实施例4本实施例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，包括以下步骤：S1、用平衡缓冲溶液平衡模拟流动床的色谱层析柱；S2、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中可同时对色谱层析柱进行抗原样品杂质清洗及样品解吸洗脱，色谱填料的清洗再生及平衡液平衡，在连续解吸洗脱过程中收集纯化后的样品。所述S2的具体步骤为：A、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中检测每根色谱层析柱流出液，当检测到第n根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，则将料液分配至第n+1根色谱层析柱内，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得FMD灭活病毒抗原纯化样品；B、当检测到第n+1根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，将料液分配至第n+2根色谱层析柱，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得灭活病毒抗原纯化样品，并清洗再生已洗脱完毕的层析柱；C、以此类推，直至第m+n根色谱柱树脂填料再生结束后，以平衡液平衡再生后的色谱层析柱继续用于吸附FMD灭活病毒抗原样品；C、第n根色谱柱树脂填料再生结束后，以平衡液平衡后作为所有n+m根色谱柱后的第1根色谱柱继续用于吸附FMD灭活病毒抗原样品，循环S2操作直至FMD灭活病毒抗原样品纯化完毕；所述n＝7，m＝11。所述模拟流动床色谱层析柱中装填的色谱填料为以苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物为基质、二乙基氨基乙基为配基的填料；填料的粒径为20um，孔径所述色的谱层析柱的长度为10cm。所述的平衡缓冲液为pH7～9，电导率5～300mscm的硫酸钠缓冲液；所述的洗涤杂质缓冲液为pH7～9，电导率5～300mscm的硫酸钠缓冲液；所述洗脱采用的洗脱溶液为pH7～9，电导率100～300mscm的硫酸钠缓冲液；所述清洗再生采用的再生清洗液为浓度为0.2-0.3％VV的吐温20。所述色谱层析柱层析工艺温度为2-15℃。采用本实施例方法分离纯化后的FMD灭活病毒抗原样品的纯度为96.5％，活性抗原回收率为97％采用本实施例方法进行连续监测，对比50次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的色谱柱可大大提高其使用寿命。实施例5本实施例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，包括以下步骤：S1、用平衡缓冲溶液平衡模拟流动床的色谱层析柱；S2、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中可同时对色谱层析柱进行抗原样品杂质清洗及样品解吸洗脱，色谱填料的清洗再生及平衡液平衡，在连续解吸洗脱过程中收集纯化后的样品。所述S2的具体步骤为：A、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中检测每根色谱层析柱流出液，当检测到第n根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，则将料液分配至第n+1根色谱层析柱内，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得FMD灭活病毒抗原纯化样品；B、当检测到第n+1根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，将料液分配至第n+2根色谱层析柱，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得灭活病毒抗原纯化样品，并清洗再生已洗脱完毕的层析柱；C、以此类推，直至第m+n根色谱柱树脂填料再生结束后，以平衡液平衡再生后的色谱层析柱继续用于吸附FMD灭活病毒抗原样品；C、第n根色谱柱树脂填料再生结束后，以平衡液平衡后作为所有n+m根色谱柱后的第1根色谱柱继续用于吸附FMD灭活病毒抗原样品，循环S2操作直至FMD灭活病毒抗原样品纯化完毕；所述n＝15，m＝9。所述模拟流动床色谱层析柱中装填的色谱填料为以苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物为基质、磺酸基为配基的填料；填料的粒径为10um，孔径所述色的谱层析柱的长度为30cm。所述的平衡缓冲液为pH7～9，电导率5～300mscm的氯化铵缓冲液；所述的洗涤杂质缓冲液为pH7～9，电导率5～300mscm的氯化铵缓冲液；所述洗脱采用的洗脱溶液为pH7～9，电导率100～300mscm的氯化铵缓冲液；所述清洗再生采用的再生清洗液为浓度为0.2-0.3％VV的吐温20。所述色谱层析柱层析工艺温度为2-15℃。采用本实施例方法分离纯化后的FMD灭活病毒抗原样品的纯度为90％，活性抗原回收率为95％采用本实施例方法进行连续监测，对比50次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的色谱柱可大大提高其使用寿命。实施例6本实施例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，包括以下步骤：S1、用平衡缓冲溶液平衡模拟流动床的色谱层析柱；S2、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中可同时对色谱层析柱进行抗原样品杂质清洗及样品解吸洗脱，色谱填料的清洗再生及平衡液平衡，在连续解吸洗脱过程中收集纯化后的样品。所述S2的具体步骤为：A、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中检测每根色谱层析柱流出液，当检测到第n根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，则将料液分配至第n+1根色谱层析柱内，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得FMD灭活病毒抗原纯化样品；B、当检测到第n+1根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，将料液分配至第n+2根色谱层析柱，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得灭活病毒抗原纯化样品，并清洗再生已洗脱完毕的层析柱；C、以此类推，直至第m+n根色谱柱树脂填料再生结束后，以平衡液平衡再生后的色谱层析柱继续用于吸附FMD灭活病毒抗原样品；C、第n根色谱柱树脂填料再生结束后，以平衡液平衡后作为所有n+m根色谱柱后的第1根色谱柱继续用于吸附FMD灭活病毒抗原样品，循环S2操作直至FMD灭活病毒抗原样品纯化完毕；所述n＝5，m＝7。所述模拟流动床色谱层析柱中装填的色谱填料为以苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物为基质、二乙基氨基丙基为配基的填料；填料的粒径为20um，孔径所述色的谱层析柱的长度为60cm。所述的平衡缓冲液为pH7～9，电导率5～300mscm的硫酸铵缓冲液；所述的洗涤杂质缓冲液为pH7～9，电导率5～300mscm的硫酸铵缓冲液；所述洗脱采用的洗脱溶液为pH7～9，电导率100～300mscm的硫酸铵缓冲液；所述清洗再生采用的再生清洗液为浓度为0.2-0.3％VV的吐温20。所述色谱层析柱层析工艺温度为2-15℃。采用本实施例方法分离纯化后的FMD灭活病毒抗原样品的纯度为95％，活性抗原回收率为95％采用本实施例方法进行连续监测，对比50次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的色谱柱可大大提高其使用寿命。实施例7本实施例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，所述步骤与实施例3基本相同，不同之处仅在于：本实施例采用的填料为二氧化硅刚性琼脂糖基料、叔丁基为配基的填料。采用本实施例方法分离纯化后的FMD灭活病毒抗原样品的纯度为88％，活性抗原回收率为80％采用本实施例方法进行连续监测，对比40次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的色谱柱可大大提高其使用寿命。实施例8本实施例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，所述步骤与实施例3基本相同，不同之处仅在于：本实施例采用的填料为丙烯酸酯基料、叔丁基为配基的填料。采用本实施例方法分离纯化后的FMD灭活病毒抗原样品的纯度为80％，活性抗原回收率为85％采用本实施例方法进行连续监测，对比45次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的色谱柱可大大提高其使用寿命。实施例9本实施例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，所述步骤与实施例3基本相同，不同之处仅在于：本实施例采用的填料为以苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物为基质、正丁基为配基的填料。采用本实施例方法分离纯化后的FMD灭活病毒抗原样品的纯度为90％，活性抗原回收率为89％采用本实施例方法进行连续监测，对比50次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的色谱柱可大大提高其使用寿命。实施例10本实施例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，所述步骤与实施例3基本相同，不同之处仅在于：本实施例采用的填料为以苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物为基质、苯基为配基的填料。采用本实施例方法分离纯化后的FMD灭活病毒抗原样品的纯度为93％，活性抗原回收率为90％采用本实施例方法进行连续监测，对比60次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的色谱柱可大大提高其使用寿命。实施例11本实施例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，所述步骤与实施例6基本相同，不同之处仅在于：本实施例采用的填料为二氧化硅刚性琼脂糖基料、二乙基氨基乙基为配基的填料。采用本实施例方法分离纯化后的FMD灭活病毒抗原样品的纯度为80％，活性抗原回收率为75％采用本实施例方法进行连续监测，对比38次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的色谱柱可大大提高其使用寿命。实施例12本实施例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，所述步骤与实施例6基本相同，不同之处仅在于：本实施例采用的填料为丙烯酸酯基料、二乙基氨基乙基为配基的填料。采用本实施例方法分离纯化后的FMD灭活病毒抗原样品的纯度为86％，活性抗原回收率为80％采用本实施例方法进行连续监测，对比40次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的色谱柱可大大提高其使用寿命。实施例13本实施例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，所述步骤与实施例6基本相同，不同之处仅在于：本实施例采用的填料为以苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物为基质、二乙基氨基乙基为配基的填料。采用本实施例方法分离纯化后的FMD灭活病毒抗原样品的纯度为90％，活性抗原回收率为88％采用本实施例方法进行连续监测，对比50次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的色谱柱可大大提高其使用寿命。实施例14本实施例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，所述步骤与实施例6基本相同，不同之处仅在于：本实施例采用的填料为以苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物为基质、季氨基为配基的填料。采用本实施例方法分离纯化后的FMD灭活病毒抗原样品的纯度为87％，活性抗原回收率为85％采用本实施例方法进行连续监测，对比55次结果，CV值小于5％。说明采用本发明的色谱柱可大大提高其使用寿命。对比例1本对比例提供了一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，所述方法与实施例4基本相同，不同之处仅在于：本对比例采用的色谱填料为：基于琼脂糖基质不含二氧化硅的填料，色谱柱层析柱的长度为30cm。经本对比例方法获得的分离纯化后的FMD灭活病毒抗原纯度为75％，活性抗原回收率为65％。经连续监测，对比15次结果，CV值大于5％。对比例2本对比例提供了一种采用常规色谱柱分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，所述色谱填料与实施例1中的相同。经本对比例方法获得的分离纯化后的FMD灭活病毒抗原纯度为80％，活性抗原回收率为75％。经连续监测，对比25次结果，CV值大于5％。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

权利要求：1.一种应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、用平衡缓冲溶液平衡模拟流动床的色谱层析柱；S2、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中可同时对色谱层析柱进行抗原样品杂质清洗及样品解吸洗脱，色谱填料的清洗再生及平衡液平衡，在连续解吸洗脱过程中收集纯化后的样品。2.根据权利要求1所述的应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，其特征在于，所述S2的具体步骤为：A、将FMD灭活病毒抗原样品上样至模拟流动床色谱层析柱中，上样过程中检测每根色谱层析柱流出液，当检测到第n根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，则将料液分配至第n+1根色谱层析柱内，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得FMD灭活病毒抗原纯化样品；B、当检测到第n+1根色谱层析柱流出液中FMD灭活病毒抗原流出液与上样样品的UV吸收一致时，将料液分配至第n+2根色谱层析柱，同时对已饱和吸附抗原的色谱层析柱进行样品洗涤杂质及样品解吸获得灭活病毒抗原纯化样品，并清洗再生已洗脱完毕的层析柱；C、以此类推，直至第m+n根色谱柱树脂填料再生结束后，以平衡液平衡再生后的色谱层析柱继续用于吸附FMD灭活病毒抗原样品；D、循环A至C的步骤，直至FMD灭活病毒抗原样品全部纯化完毕；其中，所述n≥1，n+mn，n和m均为整数，n为首次料液分配进入的色谱层析柱数；n+m为系统总的色谱层析柱数。3.根据权利要求2所述的应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，其特征在于，所述6≦n+m≦24。4.根据权利要求1所述的应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，其特征在于，所述模拟流动床色谱层析柱中装填的色谱填料为带有疏水或离子型配基的高强度聚合物填料。5.根据权利要求4所述的应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，其特征在于，所述带有疏水或离子型配基的高强度聚合物填料为：以丙烯酸酯、苯乙烯基苯、二乙烯基苯、苯乙烯、二氧化硅刚性琼脂糖、二氧化硅刚性葡聚糖或刚性纤维素中的至少一种为基质，以羟丙基、丙基、苄基、异丙基、苯基、正丁基、叔丁基、丁硫基、戊基、辛烷基、二乙基氨基乙基、磺酸基、季氨基、羧甲基、二乙基氨基丙基中的至少一种为配基的填料。6.根据权利要求4所述的应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，其特征在于，所述带有疏水或离子型配基的高强度聚合物填料为以苯乙烯和二乙烯基苯的聚合物为基质的填料。7.根据权利要求4-6任一项所述的应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，其特征在于，所述带有疏水或离子型配基的高强度聚合物填料的粒径为3um～20um，孔径8.根据权利要求1或2所述的应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，其特征在于，采用疏水型配基的填料，所述的平衡缓冲液为pH7～9，电导率100～300mscm的硫酸铵、硫酸钠或氯化铵缓冲液；采用离子型配基的填料，所述的平衡缓冲液为pH7～9，电导率5～300mscm的硫酸铵、硫酸钠或氯化铵缓冲液。9.根据权利要求1或2所述的应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，其特征在于，采用疏水型配基的填料，所述洗脱采用的洗脱溶液为pH7～9，电导率5～300mscm的硫酸铵、硫酸钠或氯化铵缓冲液；采用离子型配基的填料，所述洗脱采用的洗脱溶液为pH7～9，电导率100～300mscm的硫酸铵、硫酸钠或氯化铵缓冲液。10.根据权利要求1或2所述的应用模拟流动床分离纯化FMD灭活病毒抗原的方法，其特征在于，所述清洗再生采用的再生清洗液为氢氧化钠溶液、乙醇溶液、甲醇溶液、异丙醇溶液、尿素溶液、中性界面表面活性剂中的至少一种。

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