申请/专利权人：商丘医学高等专科学校

申请日：2020-11-26

公开（公告）日：2021-02-05

公开（公告）号：CN112322740A

主分类号：C12Q1/6886(20180101)

分类号：C12Q1/6886(20180101);C12N15/113(20100101)

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2021.02.26#实质审查的生效;2021.02.05#公开

摘要：本发明公开了基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法，采用LncRNA芯片杂交检测叶黄素处理的MCF‑7细胞中受影响的候选LncRNA，real‑time荧光定量PCR检测叶黄素处理的MCF‑7和T47D细胞中CASC9和miR‑590‑3p的表达，利用生物信息学分析预测CASC9的潜在靶点，并通过双荧光素酶报告基因检测来证实CASC9和miR‑590‑3p之间的关系。采用MTT法测定乳腺癌细胞存活率。本发明从IncRNA和miRNA的角度探索叶黄素抗癌作用的新的分子机制，为叶黄素治疗乳腺癌提供药理依据，本发明表明CASC9miR‑590‑3p轴参与了黄体素介导的乳腺癌抑制作用，具有较好的研究推广价值，利于对乳腺癌抑制有着重大积极作用。

主权项：1.基于IncRNA和miRNA的叶黄素检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、细胞系和试剂：首先获取mcf-7和T47D乳腺癌细胞株，在37℃、5％CO2、含10％胎牛血清的rpi-1640中培养；S2、逆转录-定量聚合酶链反应：用TRIzol试剂Invitrogen分离总RNA，然后用反转录试剂盒Takara,Dalian,China将提取的RNA反向转化为cDNA，Real-timePCR采用SYBRGreenTakara进行；S3、微阵列分析：将MCF7细胞分为两组，一组给予50ugml叶黄素处理，另一组不作为对照组处理，24小时后，提取细胞总RNA，反转化为cDNAinitro，然后用单色DNA标记试剂盒Nimblegen和杂交系统Nimblegen对DNA进行标记，然后进行图像采集和数据分析；S4、细胞转染：特异性的CASC9siRNAs和siRNAsi-NC、miR-590-3pmimic及其阴性对照NCmimic，细胞密度达到70％～80％后，利用lipofectamine3000ThermoFisherScientific将si-CASC9si-NC和miR-590-3pmimicNCmimic转染细胞；S5、生物信息学分析：为了研究CASC9如何调控miR-590-3p，使用生物信息学网站进行分析；S6、荧光素酶报告实验：将含有预测miR-590-3p结合位点的CASC9片段分别通过PCR扩增，克隆到pmirGLO双荧光素酶miRNA靶表达载体PromegaCooperation中，构建野生型CASC9报告载体CASC9野生型；CASC9-Wt；S7、MTT试验：转染后，以5×104cellsmL每孔100molL的密度接种于96孔微板中，加入200ulDMEM培养过夜，然后将细胞加入不同剂量的叶黄素中，在37℃、5％CO2培养箱中培养24、48、72小时后，每孔加入20个MTT5gl和200个MTT，孵育细胞；4-6h后，在570nm处用酶标仪测定OD吸光度；S8、统计分析：将数据进行统计分析。

全文数据：

权利要求：

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