申请/专利权人：中国药科大学

申请日：2018-05-02

公开（公告）日：2021-04-13

公开（公告）号：CN108586583B

主分类号：C07K14/00(20060101)

分类号：C07K14/00(20060101);A61K38/16(20060101);A61P25/00(20060101);A61P25/28(20060101);A23L33/18(20160101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.04.13#授权;2018.10.26#实质审查的生效;2018.09.28#公开

摘要：本发明涉及多肽及其应用。该多肽为系列多肽，序列为X‑GAGSGAG‑Y，其中X、Y各为限定的基团或氨基酸序列。本发明的系列多肽，能增强学习记忆能力，能治疗或预防神经退行性疾病如阿尔茨海默病，能缓解神经细胞异常死亡，具有良好的应用前景。

主权项：1.一种多肽，所述多肽的序列为SEQIDNO:1至SEQIDNO:9之一。

全文数据：多肽及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种多肽及其应用，该多肽与蚕丝中的丝素蛋白有关，其应用主要涉及增强学习记忆能力和防治神经退行性疾病，属于生物医药技术领域。背景技术[0002]生物活性肽是对机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，是一类源于蛋白质的多功能化合物。与蛋白质相比，生物活性肽分子量较小，更易于被吸收利用，是当前生物医药、保健品和食品科学研究领域的热点之一。[0003][0004]蚕丝是古代汉族文明的产物之一，也是最早被人类利用的动物纤维之一，富含十八种人体所需的氨基酸，素有“纤维皇后”的美誉。蚕丝主要由丝胶和丝素蛋白两部分组成，其中丝素蛋白是蚕丝中的主要组成部分，约占其重量的70%。丝素蛋白与其他天然高分子相比表现出明显的优越性，研究表明它具有良好的生物相容性、无污染、无毒、无刺激性、可生物降解等。因此，众多学者致力于研究、开拓丝素蛋白应用的新领域。近年，随着研究的深入，丝素蛋白已被广泛应用于生物医用材料、医药、食品等诸多方面，成为一种新型的蛋白质资源。且随着丝素蛋白新功能和新用途的不断开发，丝素肽的功能以及应用潜能也逐渐被挖掘出来。丝素肽是丝素蛋白的水解产物，具备丝素蛋白原有的优良特性和生理活性作用，且具有色泽浅，水溶性好，成药前景好等特点，尤其在生物医药和保健品领域具有较好的应用前景。[0005]神经退行性疾病是一种以异常神经元死亡丢失为共同特征的神经性疾病，主要包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩侧索硬化症等，目前具体发病机理尚不清楚，缺乏有效治愈手段。本领域亟需开发有效治疗和预防神经退行性疾病的药物。[0006]经检索发现，申请号CN200480044137.1，授权公告号CN101163712B的中国发明专利，公开了重均分子量为200〜15,000的丝素肽混合物，该丝素肽混合物通过水解丝纤蛋白制备;该丝素肽混合物具有神经保护活性，可用于恢复患有脑紊乱的受试者的受损伤的脑功能或改善正常受试者的脑功能，脑紊乱为帕金森氏病或脑缺血，脑功能为记忆或学习能力。然而，该技术方案并没有从混合物中鉴定出具体多肽序列，理应进行更进一步地研究。发明内容[0007]本发明的主要目的是:克服现有技术存在的问题，提供一种多肽，能增强学习记忆能力和防治神经退行性疾病。同时，还提供该多肽的用途。[0008]本发明解决其技术问题的技术方案如下：[0009]一种多肽，其特征是，具有如下序列:X-GAGSGAG-Y，[0010]其中，X为氢基或氨基酸序列，该氨基酸序列为GSGA、GAGS、GAGSGA、GAGSGAGAGS、GSGAGAGSGA、GAGSGTGSGA、GSGAGAGSGA、GAGSGAGAGSGA、GAGSGAGSGSGA、AGSGAGAGYGAGVGAGYGA、GAGSGAGAGYGAGVGAGYGA之一；[0011]Y为S、SG、AGS、SGA、SGSGA、AGSGAGS、SGAGAGS、AGSGAGSGA、AGSGSGAGAGS、AGSGAGSGSGA、AGSGAGAGSGAGS、AGSGAGSGAGAGS、SGAGAGSGSGAGAGS、SGSGAGAGSGAGAGS、AGYGAGVGAGYGAGAGSGAGS之一。[0012]优选地，所述多肽的序列为SEQIDNO:I至SEQIDN0:9之一。[0013]上述多肽用于制备特定功能的产品的用途;所述特定功能为增强人或动物的学习记忆能力，或者，所述特定功能为治疗或预防神经退行性疾病，或者，所述特定功能为缓解神经细胞异常死亡。[0014]所述动物包括大鼠。所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病。所述产品为药物、药物组合物或保健品。[0015]编码上述多肽的核酸。[0016]含有上述多肽或上述核酸的产品。所述产品为药物、药物组合物或保健品。[0017]含有上述多肽的混合物。[0018]发明人所在课题组对蚕丝丝素蛋白水解物进行了深入研究，通过分离、鉴定、体外合成、以及活性检测获得初步目标多肽，然后针对性设计若干多肽序列，进一步做活性检测并进行归纳总结，最终获得前文记载的一系列含有共同核心序列的多肽，它们均具有增强学习记忆能力、治疗或预防神经退行性疾病、缓解神经细胞异常死亡的生物学活性。[0019]本发明的系列多肽，能增强学习记忆能力，能治疗或预防神经退行性疾病如阿尔茨海默病），能缓解神经细胞异常死亡，具有良好的应用前景。附图说明[0020]图1为本发明实施例1的结果示意图，纵坐标为相对细胞活力。图中，Control组为阴性对照组，Αβ组为模型组，Αβ+l组为待测多肽为SEQIDNO:1的实验组，Αβ+7组为待测多肽为SEQIDNO:7的实验组。[0021]图2为本发明实施例2的结果示意图，纵坐标为相对细胞活力。图中，Control组为阴性对照组，Αβ组为模型组，Αβ+l组为待测多肽为SEQIDNO:1的实验组，Αβ+7组为待测多肽为SEQIDNO:7的实验组。[0022]图3A和图3B分别为本发明实施例3的结果示意图。图3A为定位航行实验第五天轨迹图-学习能力的考察，图3B为空间探索实验轨迹图-空间记忆能力的考察。图中，Control组为对照组，1组为SEQIDNO:1组，7组为SEQIDNO:7组。[0023]图4A和图4B分别为本发明实施例4的结果示意图。图4A为定位航行实验第五天轨迹图-学习能力的考察，图4B为空间探索实验轨迹图-空间记忆能力的考察。图中，Control组为假手术组，Αβ组为模型组，Αβ+l组为SEQIDNO:1组，Αβ+7组为SEQIDNO:7组。具体实施方式[0024]下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。[0025]实施例1、多肽对β-淀粉样蛋白诱导SH-SY5Y细胞死亡的缓解作用[0026]本实施例采用SEQIDNO:1、SEQIDΝ0:7分别作为待测多肽。[0027]实验组:选择处于对数生长期的SH-SY5Y细胞，以3XIO4个mL的密度，接种于96孔板每孔IOOyL，在37°C、5%CO2细胞培养箱中培养24h指小时，下同）。培养24h后加入0.5μMΑβ25-35即β-淀粉样蛋白），并加入0.1mgmL的待测多肽，设6个复孔，对照孔加入等量含1%胎牛血清的培养基。培养48h后，每孔加入10%培养基终体积的MTT溶液，于37°C恒温细胞培养箱内孵育4h，弃去上清液，每孔内加入150yL二甲基亚砜DMSO后，在摇床上振荡IOmin，震荡结束后置酶标仪中以570nm为检测波长，630nm为参比波长，测定各孔的OD值吸光值，并计算细胞活力。[0028]与上述实验组相比，阴性对照组不加Αβ25-35和待测多肽，模型组不加待测多肽。[0029]统计结果时，以模型组细胞活力为基准，将各组细胞活力除以模型组细胞活力，所得倍数作为各组的相对细胞活力（即模型组相对细胞活力为1。[0030]结果如图1所示，与模型组相比，多肽SEQIDN0:1、SEQIDΝ0:7均能缓解β-淀粉样蛋白诱导的SH-SY5Y细胞死亡。[0031]实施例2、多肽对β-淀粉样蛋白诱导原代海马神经元死亡的缓解作用[0032]本实施例采用SEQIDNO:1、SEQIDΝ0:7分别作为待测多肽。[0033]实验组:采用DMEM高糖+10%FBS为种植培养基，Neurobasal+2%B27+0.5mmolL谷氨酰胺为维持培养基。包被96孔板:每孔加入0.ImL50ygmLPDL溶液（S卩多聚赖氨酸溶液），3h后吸出，放于细胞培养箱过夜晾干;次日采用无菌PBS溶液洗涤细胞板3次，置于细胞培养箱晾干待用。选择孕满18天大鼠，10%水合氯醛溶液麻醉，75%酒精全身消毒;大鼠置于冰袋上，剖腹取胎鼠，置于无菌预冷的PBS溶液中；无菌条件下剪开胎鼠头皮、颅骨，以脑中线为起点，仔细拨开大脑颞叶皮层，暴露出海马区域，弯头镊夹出海马组织，充分剪碎组织，置于种植培养基中；4mL0.125%胰酶溶液消化5min;加入同体积种植培养基终止消化，轻柔吹打成为单细胞悬液，过200目筛网，滤除未完全消化的组织、碎片;将单细胞悬液转移至离心管，以IOOOrpm离心5min，弃去上清，用种植培养基重悬细胞;细胞计数，铺板，细胞密度为IXIO5个孔，置于37°C、5%CO2细胞培养箱中培养，8h细胞贴壁后换维持培养基;每2-3天换一次液，至第7-8天，海马神经元已基本成熟。每孔加入ΙΟμΜΑβ25-35,继续培养6h后，加入0.1mgmL的待测多肽，设6个复孔，对照孔加入等量含1%胎牛血清的培养基。培养48h后，每孔加入10%培养基终体积的MTT溶液，于37°C恒温细胞培养箱内孵育4h，弃去上清液，每孔内加入150yL二甲基亚砜DMSO后，在摇床上振荡IOmin，震荡结束后置酶标仪中以570nm为检测波长，630nm为参比波长，测定各孔的OD值吸光值。[0034]与上述实验组相比，阴性对照组不加Αβ25-35和待测多肽，模型组不加待测多肽。[0035]结果如图2所示，与模型组相比，多肽SEQIDNO:1、SEQIDΝ0:7均能缓解β-淀粉样蛋白诱导的原代海马神经元死亡。[0036]实施例3、多肽对大鼠学习记忆能力的增强作用[0037]本实施例采用SEQIDNO:1、SEQIDΝ0:7分别作为待测多肽。[0038]取Wistar雄性大鼠50只饲养于温度为25±2°C的SPF级动物房中，自由饮食及水，每日光照12h。这些实验大鼠被随机分为5组，每组10只，分别为:PBS对照组、SEQIDNO:1组2mgkg、SEQIDN0:7组2mgkg。待测多肽皮下给药，对照组皮下注射I3BS;连续给药14天。Morris水迷宫系统评价实验大鼠的空间学习及记忆能力。[0039]Morris水迷宫系统主要包括：圆柱状水池及可移动平台（直径为10cm、录像系统、数据分析系统；圆柱状水池直径为150cm，深度为60cm，被均分为4个象限，移动平台位于其中一个象限中间；摄像机与计算机相连并位于水池正上方，用于记录大鼠的运动状态;实验过程中，水池中需要注入清水，水面高出平台2cm左右，水温控制在25±2°C;无毒的黑色墨水被加到清水中。水迷宫实验分为2部分:空间探索实验及定位航行实验。定位航行实验用于评价大鼠的空间学习能力；给药后第9天开始该实验，为期5天，将大鼠面向池壁放入池内，如果大鼠在90s内找到平台并在平台上停留5s，训练停止，如果大鼠在90s内没有找到平台，则需引导大鼠到达平台并在平台上停留15s，系统自动记录大鼠的游泳轨迹、逃避潜伏期及游泳速度等。空间探索实验用于评价大鼠的空间记忆能力；给药后第14天将平台从池中撤出，而后将大鼠从与原平台所在象限相对的象限中面向池壁放入水中，让其在水中游泳90s，系统自动记录大鼠的游泳轨迹、原平台所在象限停留时间及穿越原平台所在位置的次数等。[0040]结果如表IA和表1B、图3A和图3B所示，与对照组相比，待测多肽给药组实验大鼠的逃避潜伏期较短，在原平台所在象限停留时间及穿越原平台所在位置的次数较多，这表明待测多肽SEQIDNO:1、SEQIDN0:7均能提高大鼠的学习记忆能力。[0041]表1A、定位航行实验第五天的潜伏期[0042][0043]实施例4、多肽对β_淀粉样蛋白诱导阿尔茨海默病动物模型认知能力和记忆功能退化的缓解作用[0044]本实施例采用SEQIDNO:1、SEQIDΝ0:7分别作为待测多肽。[0045]选用Wistar雄性大鼠（230±20g，随机分为假手术组和预备实验组，以侧脑室注射Αβ25-35建立阿尔茨海默病大鼠模型，具体造模操作如下:腹腔注射10%水合氯醛350mgkg麻醉大鼠，并将其固定在脑立体定位仪上;常规消毒后，取头顶正中剪开皮肤，钝性分离粘膜等组织，暴露出前囟；根据大鼠脑立体定位图谱定位；在前囟后1.0mm，矢状缝两侧1·5mm处分别用1·Omm钻头钻破颅骨；ΙΟμπι微量进样器进针，深度3·8mm;每侧缓慢注射5yL液体控制注射速度lyLmin，注射器留置IOmin;缓慢退针，缝合伤口，涂抹青霉素粉末预防感染。其中，假手术组注射的液体为PBS，预备实验组注射的液体为Αβ25-355nmol。[0046]取已造模的Wistar雄性大鼠，假手术组10只，预备实验组50只，饲养于温度为25土2°C的SPF级动物房中，自由饮食及水，每日光照12h。假手术组实验大鼠直接作为后续的假手术组；预备实验组实验大鼠则随机分为5组，每组10只，分别为模型组、SEQIDNO:1组0.4mgkg、2mgkg、SEQIDN0:7组（0.4mgkg、2mgkg。[0047]对各组大鼠实施皮下给药，假手术组、模型组分别皮下注射PBS，待测多肽组分别皮下给药对应的多肽;连续给药14天。Morris水迷宫系统评价实验大鼠的空间学习及记忆能力（同实施例3。[0048]结果如表2A和表2B、图4A和图4B所示，与模型组相比，SEQIDNO:1组、SEQIDNO:7组均显著缩短模型大鼠逃避潜伏期，提高模型大鼠在原平台所在象限停留时间及穿越原平台所在位置的次数，这表明待测多肽SEQIDNO:1、SEQIDNO:7均对β-淀粉样蛋白诱导阿尔茨海默病动物模型认知能力和记忆功能退化具有缓解作用。[0049]表2Α、定位航行实验第五天的潜伏期[0050][0051]表2Β、空间探索实验[0052][0053]实施例5、系列多肽的考察[0054]发明人在研究中首先考察了9条多肽序列，S卩SEQIDNO:1至SEQIDΝ0:9,它们的序列如下：[0055]SEQIDNO:IGAGSGAGAGSGAGAGSGAGS[0056]SEQIDNO:2GAGSGAGAGSGAGSGAGAGS[0057]SEQIDNO:3GSGAGAGSGAGAGSGAGSGA[0058]SEQIDNO:4GAGSGAGAGYGAGVGAGYGAGAGSGAGS[0059]SEQIDNO:5GAGSGTGSGAGAGSGAGAGS[0060]SEQIDN0:6AGSGAGAGYGAGVGAGYGAGAGSGAGSG[0061]SEQIDN0:7GAGSGAGSGAGAGSGSGAGAGS[0062]SEQIDNO:8GAGSGAGSGSGAGAGSGAGAGS[0063]SEQIDNO:9GSGAGAGSGAGAGSGAGSGSGA[0064]其中，SEQIDNO:1、SEQIDN0:7的考察如实施例1至4所示，其余7条多肽也做了同样的考察限于篇幅限制，具体实验数据不在此处列出），考察结果显示，它们均具有对β-淀粉样蛋白诱导SH-SY5Y细胞死亡的缓解作用，对β-淀粉样蛋白诱导原代海马神经元死亡的缓解作用，对大鼠学习记忆能力的增强作用，对淀粉样蛋白诱导阿尔茨海默病动物模型认知能力和记忆功能退化的缓解作用。[0065]在此研究基础上，发明人以这9条多肽序列总结出通式:X-GAGSGAG-Y，其中，X为氢基或氨基酸序列，该氨基酸序列为GSGA、GAGS、GAGSGA、GAGSGAGAGS、GSGAGAGSGA、GAGSGTGSGA、GSGAGAGSGA、GAGSGAGAGSGA、GAGSGAGSGSGA、AGSGAGAGYGAGVGAGYGA、GAGSGAGAGYGAGVGAGYGA之一；[0066]Y为S、SG、AGS、SGA、SGSGA、AGSGAGS、SGAGAGS、AGSGAGSGA、AGSGSGAGAGS、AGSGAGSGSGA、AGSGAGAGSGAGS、AGSGAGSGAGAGS、SGAGAGSGSGAGAGS、SGSGAGAGSGAGAGS、AGYGAGVGAGYGAGAGSGAGS之一。[0067]按此所得多肽如下表所示：[0068][0071][0072]将其中与SEQIDNO:1至SEQIDN0:9重复的序列去掉，并将实际序列相同的归并为一条序列，这样最终所得的若干条多肽，按之前的实施例方法分别进行检测。受篇幅所限，具体实验数据不在此处——列出。结果表明，这些多肽均与SEQIDNO:1至SEQIDNO:9一样具有各项生物学活性。[0073]由以上实施例可知，本发明的系列多肽，能增强学习记忆能力，能治疗或预防神经退行性疾病如阿尔茨海默病），能缓解神经细胞异常死亡，具有良好的应用前景。[0074]除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

权利要求：1.一种多肽，其特征是，具有如下序列:X-GAGSGAG-Y，其中，X为氢基或氨基酸序列，该氨基酸序列为GSGA、GAGS、GAGSGA、GAGSGAGAGS、GSGAGAGSGA、GAGSGTGSGA、GSGAGAGSGA、GAGSGAGAGSGA、GAGSGAGSGSGA、AGSGAGAGYGAGVGAGYGA、GAGSGAGAGYGAGVGAGYGA之一；Y为S、SG、AGS、SGA、SGSGA、AGSGAGS、SGAGAGS、AGSGAGSGA、AGSGSGAGAGS、AGSGAGSGSGA、AGSGAGAGSGAGS、AGSGAGSGAGAGS、SGAGAGSGSGAGAGS、SGSGAGAGSGAGAGS、AGYGAGVGAGYGAGAGSGAGS之一。2.根据权利要求I所述的多肽，其特征是，所述多肽的序列为SEQIDNO:I至SEQIDNO:9之一。3.权利要求1或2所述多肽用于制备特定功能的产品的用途;所述特定功能为增强人或动物的学习记忆能力，或者，所述特定功能为治疗或预防神经退行性疾病，或者，所述特定功能为缓解神经细胞异常死亡。4.根据权利要求3所述的用途，其特征是，所述动物包括大鼠。5.根据权利要求3所述的用途，其特征是，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病。6.根据权利要求3所述的用途，其特征是，所述产品为药物、药物组合物或保健品。7.编码权利要求1或2所述多肽的核酸。8.含有权利要求1或2所述多肽或权利要求7所述核酸的产品。9.根据权利要求8所述的产品，其特征是，所述产品为药物、药物组合物或保健品。10.含有权利要求1或2所述多肽的混合物。

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