申请/专利权人：中国人民武装警察部队总医院

申请日：2016-02-26

公开（公告）日：2021-08-03

公开（公告）号：CN109022600B

主分类号：C12Q1/689(20180101)

分类号：C12Q1/689(20180101);C12Q1/04(20060101);C12N15/11(20060101);C12N1/21(20060101);C12N15/74(20060101);C12R1/01(20060101)

优先权：["20151224 CN 201510991171X"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.08.03#授权;2019.01.11#实质审查的生效;2018.12.18#公开

摘要：本发明公开了布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351的应用，其中ncRNA1351回复株，命名为16M‑ncRNA1351，由ncRNA1351缺失突变株16M△ncRNA1351转化有序列表中SEQIDNO：3所示的ncRNA1351回复载体ncRNA1351‑MCS。该ncRNA1351回复株可用于以ncRNA1351为靶点的抗布鲁氏菌药物筛选中。

主权项：1.用于检测布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351DNA表达的引物，包括：ncRNA1351-RT-F:GGTCGAGAAATTGCGACTGA，和ncRNA1351-RT-R：GGCGGCGTTTTCGTTTC；所述ncRNA1351为来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，或为序列表中SEQIDNO：l所示核苷酸序列经硫代修饰或／和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。

全文数据：布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351的应用[0001]本申请为申请日2016年2月26日、申请号201610108291.5、发明名称“布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNAl351及其应用”的分案申请。技术领域[0002]本发明涉及细菌非编码小RNAsmallnon-codingRNA，sRNA，特别是涉及一个来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351及其功能与应用。背景技术[0003]细菌非编码小RNAsmallnon-codingRNA，sRNA是近年来在细菌等原核生物中发现的一类RNA调控子，它们不编码蛋白质，通常位于基因间区，长度在50-400个核苷酸之间，广泛参与体内多种生命活动的调控。目前，非编码小RNA已成为生命科学研究的前沿和热点。细菌sRNA是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调节因子，在应对环境变化的基因表达调控中发挥重要作用。sRNA主要通过碱基配对与靶标mRNA结合来发挥生物调控作用。迄今为止，大部分细菌sRNA的研究集中在大肠杆菌等模式生物，但随着研究的深入，已有越来越多的研究转向致病菌，如:霍乱弧菌、产单核细胞李斯特菌、铜绿假单胞菌、结核杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌等。在这些病原菌中，已经证实sRNA在转录后水平调控基因的表达，并在压力应答和毒力调控中发挥重要作用。[0004]布鲁氏菌病是由布鲁氏菌入侵机体引起的人畜共患传染病，在我国广泛流行，不仅给我国畜牧业生产造成巨大的经济损失，也严重威胁人民的健康生活，是一个重要的公共卫生问题。布鲁氏菌是胞内寄生菌，主要寄生于机体的单核细胞主要是巨噬细胞）内，胞内存活和复制是布鲁氏菌致病的关键，而适应胞内的环境又是布鲁氏菌实现胞内生存的关键。因此，了解布鲁氏菌如何适应胞内的恶劣环境并在其中生存对于理解布鲁氏菌的致病机理至关重要。由于sRNA是细菌适应环境压力的重要调节因子，发明人推测出sRNA在布鲁氏菌的胞内生存和毒力调控中发挥一定的作用。因此，识别布鲁氏菌的sRNA并对其功能进行研究将有助于理解布鲁氏菌的致病机理。已有研究人员对布鲁氏菌非编码小RNA进行了预测，包括BSR-2，BSR-16等，专利文献CN103710345A也公开了一个与布鲁氏菌的胞内生存和毒力相关的布鲁氏菌非编码小RNA。发明内容[0005]本发明的目的是利用来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子，提供用于检测其表达量的引物、探针，以及提供该RNA分子的回复菌株。[0006]本发明所述来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子smallnon-codingRNA，sRNA，命名为ncRNA1351，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示，或与序列表中SEQIDNO:I所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并与布鲁氏菌毒力和胞内生存能力相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQIDN0:1所示核苷酸序列经硫代修饰或和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。[0007]ncRNA1351回复载体属于本发明。回复载体命名为ncRNA1351-MCS，由序列表中SEQIDNO:3所示。[0008]布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351回复株属于本发明，其命名为16M-ncRNA1351，是由序列表中SEQIDN0:3所示的回复载体ncRNA1351-MCS转化得到。[0009]具体的，将回复载体ncRNA1351-MCS质粒DNA电转化至ncRNA1351缺失突变株16ΜΛncRNAl351电感受态细胞，筛选双抗性克隆即为ncRNAl351回复菌株16M-ncRNAl351。[0010]所述ncRNA1351缺失突变株16MAncRNA1351，是以布鲁氏菌Brucellamelitensis16M为出发菌株转化ncRNA1351缺失突变载体ncRNA1351-NC-T其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示得到。[0011]非编码小RNA分子ncRNAl351回复株16M_ncRNAl351在抗布鲁氏菌药物筛选中的应用也属于本发明。[0012]用于检测布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351DNA表达的引物也属于本发明，该引物包括：[0013]ncRNAl351-RT-F:GGTCGAGAAATTGCGACTGA，和[0014]ncRNAl35卜RT-R:GGCGGCGTTTTCGTTTC〇[0015]检测布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351RNA表达的探针也属于本发明，该探针为地高辛标记探针，序列为：[0016]ACGGTCGAGAAATTGCGACTGATGCCATCTTAGCTACATACCCCCGGCTGACATGGTAAGGATAGCCCCGGAAAGCCATCGGTTCCCTATAGTGAGTCGTATTA。[0017]本发明用生物信息学的方法预测和分析出一个新的布鲁氏菌非编码小RNAncRNA1351。Northernblot实验证实了ncRNA1351在布鲁氏菌中的存在。通过构建ncRNA1351的布鲁氏菌缺失突变株和回复株对ncRNA1351的功能进行了分析，实验结果表明:ncRNA1351缺失以后，布鲁氏菌在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力明显减弱，而且在小鼠体内的生存能力也下降，说明ncRNAl351与布鲁氏菌的毒力相关。因此，可以ncRNA1351为靶点制备抗布鲁氏菌药物，其长105nt，相较于已有研究的RNABSR0601的长度更短，更具有应用价值。本发明将在布鲁氏菌病的预防和治疗中发挥重要作用，ncRNA1351回复株可用于在以ncRNA1351为靶点的抗布鲁氏菌药物筛选中。[0018]下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。附图说明[0019]图1为ncRNA1351在布鲁氏菌Brucellamelitensis16M不同生长时期表达情况的Northernblot检测结果；[0020]图2为ncRNAl351在酸、热、营养缺乏、氧化应激等模拟巨噬细胞内环境的不同应激条件下的转录情况；[0021]图3A为ncRNAl351缺失突变载体ncRNAl351-NC-T的物理图谱；[0022]图3B为ncRNAl351回复载体ncRNAl351-MCS的物理图谱；[0023]图4为ncRNA1351缺失突变株16MAncRNA1351和ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351的RT-PCR鉴定结果；[0024]图5为ncRNA1351缺失突变株16MAncRNA1351和ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力分析结果；[0025]图6为ncRNA1351缺失突变株16MAncRNA1351和ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351的小鼠毒力实验结果。具体实施方式[0026]下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALaboratoryManual》（Sambrook，J·，RusselI，Davidff.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor〇[0027]所述百分比浓度如无特别说明均为质量质量WW，单位glOOmL百分比浓度、质量体积WV，单位g100mL百分比浓度或体积体积VV，单位mL100mL百分比浓度。[0028]实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。[0029]羊布鲁氏菌Brucellamelitensis或B.melitensis16M野生株）由国家CDC提供。[0030]所用引物和探针由大连宝生物公司合成，质粒由上海生工生物工程有限公司合成。[0031]实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。[0032]实施例1、获得布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351的序列[0033]从NCBIftp:ftp.ncbi.nih.govgenomesBacteria下载布鲁氏菌Brucellamelitensis或B.melitensis16M野生株）的染色体序列（NC_003317·1和NC_003318.1两条染色体，命名为I和II，从下载的序列中提取基因间区（指的是两个开放阅读框之间的序列）片段。在基因间区用pftools2.3http:www.isrec.isb-sib.chftp-serverpftools寻找启动子cut-off阈值值取255，用RNAMotif寻找终止子，其中的motifdescriptor主题描述符）来自（http:www·tufts·edusacklerwaIdorlabsRNAPredict，然后再在去冗余指的是重复的序列）基础上预测出具有完整转录单元的基因间区，去除含有tRNA和rRNA的序列，最后，通过BLAST比对，找出保守的基因间区作为候选的（smallnon-codingRNA，sRNA序列。[0034]在候选的sRNA序列中，ncRNA1351是在布鲁氏菌Brucellamelitensis16MI号染色体的反义链上预测的非编码小RNA，其核苷酸序列如序列表中SEQIDN0:1所示，其5’端为1405195指的是Genbank里面的序列号），3’端为1405091指的是Genbank里面的序列号），长105nt，其编码基因位于Brucellamelitensis16M的BMEI1351指的是Genbank里面的位点号码和BMEI1350指的是Genbank里面的位点号码之间的基因间区。BLAST比对结果表明，ncRNA1351在布鲁氏菌菌种间的同源性达到100%，说明ncRNA1351具有高度的保守性，这一点也符合sRNA的特征。[0035]实施例2、ncRNA1351在布鲁氏菌16M不同生长时期表达情况的Northernblot验证[0036]Northernblot是鉴定非编码小RNA的金标准。由于非编码小RNA的表达通常具有生长时期依赖性，因此，可用Northernblot检测ncRNA1351在布鲁氏菌16M不同生长时期的表达情况。具体方法包括以下步骤：[0037]1根据ncRNA1351的编码序列设计引物，并在反向引物外侧添加T7启动子序列，弓丨物序列为ncRNA1351-p-F:ACGGTCGAGAAATTGCGA和ncRNA1351-p-R:TAATACGACTCACTATAGGGAACCGATGGCTTTCCGGG带下划线序列为T7启动子序列）。[0038]2首先以羊布鲁氏菌Brucellamelitensis16M野生株）的基因组DNA为模版，用引物ncRNA1351-p-F和ncRNA1351-p-RPCR扩增制备探针的DNA模板，25ylPCR反应体系为：10Xbuffer2·5μ1，dNTPs2·5mmolL2μ1，引物ncRNA1351-p-FlOymolL0·5μ1，引物ncRNA135卜p-R10ymolL0.5yl，EXTaq5UmL0.2yl，模板DNA3yl，ddH2〇17yLPCR反应条件为：951€7111丨11;951€3〇8,561€3〇8,721€3〇8,30个循环；72°：1〇11^11。[0039]3以步骤2获得的DNA为模板，用T7聚合酶体外转录制备ncRNA1351的地高辛标记探针，探针序列为：[0040]ACGGTCGAGAAATTGCGACTGATGCCATCTTAGCTACATACCCCCGGCTGACATGGTAAGGATAGCCCCGGAAAGCCATCGGTTCCCTATAGTGAGTCGTATTA[0041]转录体系为：模板DNAlyg，DIG_ll_UTPMix2yl，5XTranscriptionbuffer4μI，RiboLock™RNaseInhibitor4〇υμ1lyl，T7RNAPolymerase2〇υμ11.5yl，DEPC水定容到20μ1，混匀。转录条件为:在PCR仪中37°C体外转录反应2h;加入IylDNaseI2UAU37。:处理消化DNA30min;然后加入2μ1EDTA0.2M，pH8.0终止反应；加入30μ1DEPC处理过的水，使总体积达到50μ1;加入110体积的5Μ乙酸铵5μ1涡旋混匀和3倍体积预冷的无水乙醇（150μ1，-20°C放置过夜；12，OOOrpm、4°C离心15min，75%乙醇漂洗2次，弃上清，空气干燥。用50μ1DEPC水溶解RNA探针。并向其中加入20URNaseInhibitor，5yl分装，-80°C保存。[0042]4将羊布鲁氏菌Brucellamelitensis16M野生株分别培养至对数生长早期EP，OD6qq=0.5和平台期（ST，OD6qq=2.0，采用Trizol法提取羊布鲁氏菌Brucellamelitensis16M的总RNA，以羊布鲁氏菌（Brucellamelitensis16M的总RNA为模版，用步骤3制备的探针进行Northernblot验证。[0043]Northernb1〇t验证结果如图1所不，ncRNAl351在羊布鲁氏菌（BruceIIamelitensis16M的对数生长中期和平台期有转录，证明在布鲁氏菌16M中确实存在ncRNA1351〇[0044]实施例3、ncRNAl351在模拟巨噬细胞内环境的不同应激条件下的表达分析[0045]细菌sRNA的表达与应激条件有关，因此，可用RT-PCR的方法对ncRNA1351在酸、营养缺乏、氧化应激等模拟巨噬细胞内环境的不同应激条件下的转录情况进行了检测。具体方法包括以下步骤：[0046]1将培养至对数生长中期0D6qq=1.2的羊布鲁氏菌Brucellamelitensis16M野生株菌液进行离心，收集菌体，将菌体分别在①TSBTSB为大豆胰蛋白胨肉汤，购自生物梅里埃公司）7.0pH为7.0,标准）、②GEM7.0营养缺乏培养基，每升培养基中含MgS〇4.7H200.2g，Citricacid.H202.0g，K2HP〇410.0g，NaNH4HP〇4.4H2〇3.5g，葡萄糖20g，调pH为7.0、③TSB7.0,42°C热刺激）、④TSB4.0酸）、⑤TSB7.0，1.5mMH2〇2高氧条件下，培养30min。[0047]2采用Trizol法提取在不同条件培养的羊布鲁氏菌Brucellamelitensis16M的RNA，RNA用DNAseI消化后作为模版，用引物ncRNA1351-RT-F:GGTCGAGAAATTGCGACTGA和ncRNAl351-RT-R:GGCGGCGTTTTCGTTTC检测ncRNAl351的表达水平，用引物16sRNA-RT-F:CACTGGACCATTACTGACGC和16sRNA-RT-R:ACTAAGGGCGAGGGTTGC检测16SrRNA的表达水平，16SrRNA为阳性内对照基因，25ylPCR反应体系为：2XonestepSYBRRT-PCRBuffer12.5μΐ,TakaraExTaq5Uyl0.5μ1,RTEnzymeMixII0.5μ1,ForwardprimerΙΟμΜΙμΐ,Reverseprimer10yMlyl，RNasefreeH2O8.5yl，TotalRNA100ng;PCR反应条件为：42°C5min;95°CIOs;95°C5s，56°C30s，72°C30s，45个循环。[0048]3相对定量的计算采用方法分析，即ΔCt目标基因=Ct目标基因）-Ct同一样本16SrRNA;ΔΔCt目标基因=ΔCt目标基因（实验组-ΔCt目标基因（对照组），相对倍数实验组对照组）=2_AAet。实验进行3次，以TSB7.0条件为对照组相对转录水平设为1，其余条件为实验组。重复实验3次，计算平均值。[0049]检测结果如图2所示，可以看出，ncRNA1351在酸TSB4.0、营养缺乏GEM7.0、氧化应激条件H2O2和热42°C等模拟巨噬细胞内环境的应激条件下的表达量明显增加，提示ncRNA1351可能与布鲁氏菌适应巨噬细胞内环境有关。[0050]实施例4、ncRNA1351的功能分析[0051]为了进一步分析ncRNA1351在布鲁氏菌胞内生存和毒力中发挥的作用，构建了ncRNAl351的突变株和回复株，并进行了相关表型实验。[0052]1、ncRNAl351突变株和回复株的构建及验证[0053]以羊布鲁氏菌Brucellamelitensis16M野生株）的基因组DNA为模板，用引物ncRNA1351-N-F和ncRNA1351-N-R扩增ncRNA1351的N端同源臂，用引物ncRNA1351-C-F和ncRNA1351-C-R扩增ncRNA1351的C端同源臂。以PUC19K购自大连宝生物公司）为模板，用引物Kana-F和Kana-R扩增卡那霉素抗性基因（Kan基因）JCR扩增产物用DNA胶纯化回收试剂盒购自Promega公司）回收后，将N端同源臂、C端同源臂和Kan基因等摩尔比混合作为模板，进行融合PCR扩增。PCR扩增分两轮进行，分别命名为PCR-I和PCR-2。[0054]1引物序列[0055][0056][0057][0058][0059][0060][0061][0062][0063]2融合PCR扩增[0064]PCR-I反应体系：PyrobestpolymeraseIOXPCRBufferMgi+Plus[0065]dNTPMixture各2.5mM模板加去离子水至25μI;[0066]PCR-I反应条件：94°C5min;94°C30s，66°C30s，72°C60s，10个循环。[0067]将得到的PCR-I液稀释10倍作为第二步PCRPCR-2的模板，进行第二轮PCR扩增。[0068]PCR-2反应体系：LApolymeraseIQXLAPCRBufferIIMg2+Plus[0069]dNTPMixture2.5mMeachncRNAl351-N-F20pMncRNA1351-C-R20μM[0070]模板加去离子水至50μI.;[0071]PCR-2反应条件：94°C5min;94°C30s，56°C30s，72°C60s，30个循环；72°CIOmin。将PCR-2反应产物用DNA胶纯化回收试剂盒进行切胶回收，得到的回收片段即为ncRNA1351缺失突变盒，将其命名为ncRNA1351-NC。[0072]3构建ncRNA1351缺失突变载体[0073]将缺失突变盒ncRNA1351-NC和pMD18-TSimpleVector购自大连宝生物公司）进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，将转化产物涂布氨苄（lOOygmL抗性LB平板，对平板上的抗性克隆用引物ncRNAl351-N-F和ncRNAl351-C-R进行菌落PCR鉴定。扩增出1997bpDNA片段此DNA片段为N端同源臂、Kan基因和C端同源臂的融合片段的为阳性克隆，将鉴定为阳性的克隆提取质粒，对质粒用KpnI酶进行酶切鉴定，经酶切获得4689bp大小DNA片段的阳性质粒，表明ncRNA1351缺失突变载体ncRNA1351-NC-T构建成功，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示，物理图谱如图3A所示。[0074]⑷ncRNAl351缺失突变株的筛选与鉴定[0075]将缺失突变载体ncRNA1351-NC-T质粒DNA与80μ1羊布鲁氏菌Brucellamelitensis16Μ感受态细胞充分混勾，预冷15min，然后于18kVcm、400Ω条件下进行电击，电击后立即加入ImLTSB培养基重悬细菌，转入1.5mL离心管中37°C复苏24h，复苏后的转化产物经系列稀释后涂布含有50ygmL卡那霉素的TSA平板，37°C培养72h以上，筛选卡那霉素抗性克隆，即为ncRNA1351缺失突变株，将其命名为16MAncRNA1351。[0076]5构建ncRNAl351回复载体[0077]以羊布鲁氏菌Brucellamelitensis16M的基因组DNA为模板，以ncRNA1351_N_F和ncRNAl351-C-R为引物进行PCR扩增。PCR扩增产物经DNA胶纯化回收试剂盒切胶回收后用KpnI和PstI双酶切，与经同样酶双酶切的质粒pRRlMCS-4参见文献KovachM，ElzerP，StevenHillD，etal.Fournewderivativesofthebroad-host-rangecloningvectorpBBRIMCS,carryingdifferentantibiotic-resistancecassettes.Gene，1995，166:175-176.用T4DNALigase连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，转化产物涂布氨苄霉素（lOOygmL抗性LB平板，对平板上的抗性克隆用引物pBBRl-F和pBBRl-R进行PCR鉴定。扩增出1204bpDNA片段的为阳性克隆，将鉴定为阳性的克隆提取质粒，提取的质粒即为回复载体，将其命名为ncRNA1351-MCS，其核苷酸序列如序列表中SEQIDN0:3所示，物理图谱如图3B所示。[0078]⑹ncRNA1351回复菌株的筛选[0079]将回复载体ncRNAl351-MCS质粒DNA电转化至16MAncRNAl351电感受态细胞，涂布含有50ygmL卡那霉素和100ygmL氨苄霉素的TSA双抗性平板，37°C培养72h以上，筛选双抗性克隆，双抗性克隆即为ncRNA1351回复菌株，命名为16M-ncRNA1351。[0080]716MAncRNA1351和16M-ncRNA1351的RT-PCR验证[0081]为了验证ncRNA1351缺失突变株和ncRNA1351回复株，可用RT-PCR的方法分析羊布鲁氏菌（Brucellamelitensis16M野生株）、16MZ\ncRNA1351和16M_ncRNA1351这三株菌中ncRNA1351的转录情况，从转录水平对ncRNA1351缺失突变株和ncRNA1351回复株进行验证。将这三株菌在TSB培养基中培养至对数生长中期OD6qq=I.2，然后采用TrizolRNA提取方法抽提总RNA。总RNA用DNAseI消化后，以随机引物为逆转录引物，用M-MLV逆转录酶逆转录成cDNA，反应体系和反应条件为:2yg的总RNA加上Iyg随机引物，将PCR管于PCR仪中70°C放置10min，解开模板中的二级结构;迅速将PCR管置于冰上停留5min以防止二级结构重新形成;短暂离心，将溶液收集到管底;按如下顺序将下列成分加入到引物和模板的混合物中：M-MLV5Xreactionbuffer5yl，dNTP2.5mMeach5yl，RNasin®.RibonucleaseInhibitor4〇υμ125U，M-MLV逆转录酶200UAUΙμΐ，水无核酸酶至25μ1;轻弹管壁，混合反应液，37°C孵育60min。再以cDNA为模板，用针对ncRNA1351的引物ncRNA1351-RT-F和ncRNA1351-RT-R进行RT-PCR验证，PCR反应体系为：模板lyl，dNTPs2.5mMeach2μ1，上游引物（20μΜ0·5μ1，下游引物（20μΜ0·5μ1，10XPCRBuffer2·5μ1，rTaq5υμ10·125μ1，无菌去离子水至25yl;PCR反应条件为:951€51^11;951€3〇8、6〇1€3〇8、721€3〇8,30个循环；72°C7min〇[0082]结果如图4所示，可以看出，羊布鲁氏菌（Brucellamelitensis16M、16ΜΛncRNA1351和16M-ncRNA1351中16srRNA的表达量是相同的，说明这三株菌的cDNA量是一致的。因此，可以进行这三株菌的ncRNA1351表达分析。16MAncRNA1351中没有ncRNA1351的表达，而16M-ncRNA1351中ncRNA1351的表达得到了回复，实验结果证实ncRNA1351缺失突变株16MAncRNA1351和ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351构建成功。[0083]2、ncRNA1351缺失突变株和回复株在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存能力分析[0084]布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，在巨噬细胞的内环境中包含多种杀抑菌机制，因此布鲁氏菌必须适应这些机制才能在胞内生存繁殖。为分析ncRNA1351在布鲁氏菌抵抗和适应这些条件中的作用，可在体外模拟多个胞内条件，包括氧化压力、热压力、酸压力、高渗透压等，分别将羊布鲁氏菌（Brucellamelitensis16Μ、16ΜΔncRNA1351、16M_ncRNA1351在这些条件下进行处理，然后观察它们各自在这些条件作用下的存活率。[0085]具体实验方法：将培养至对数生长中期（OD6qq=I.2的羊布鲁氏菌Brucellamelitensis16M野生株）、16MΔncRNA1351、16M-ncRNA1351菌液离心，PBS洗1次后将菌体重悬并振荡培养于①含440mMH2O2的TSB液体40min中；②50°C预热的TSB液体60min;③ρΗ3·0的TSB液体（IOmin;④1.5M的NaCl水溶液（30min;⑤37°C的TSB液体40min，对照）等不同的培养基中，倍比稀释后涂布TSA平板进行计数，观察羊布鲁氏菌Brucellamelitensis16M、16MAncRNA1351、16M-ncRNA1351在高渗透压、氧化压力、热压力和酸压力环境中的存活力。结果以百分比表示，将对照组细菌的生存率设为100%。重复实验3次，计算平均值。[0086]结果如图5所示，可以看出，与羊布鲁氏菌（Brucellamelitensis16M相比，ncRNA1351缺失突变株16MAncRNA1351在高渗透压、氧化、热和酸刺激条件下的生存能力明显减弱，结果提示，ricRNA1351缺失以后，布鲁氏菌在体外刺激条件下的生存能力减弱；与ncRNA1351缺失突变株16MAncRNA1351相比，ncRNA1351回复株16M-ncRNA1351在高渗透压、氧化、热和酸刺激条件下的生存能力又得到了回复。实验结果表明，ncRNA1351的正确表达对于布鲁氏菌在模拟巨噬细胞内环境的压力条件下的生存是必需的。[0087]3、ncRNA1351缺失突变株和回复株的小鼠毒力实验[0088]布鲁氏菌是一种胞内寄生菌，布鲁氏菌在感染后，首先侵袭的是宿主的局部淋巴结，而后再迀移到其它的器官和组织。脾脏是一种免疫细胞丰富的器官，而布鲁氏菌主要寄生于吞噬细胞，因此脾脏是布鲁氏菌寄居的主要场所之一。布鲁氏菌致病性的重要指标之一是脾脏的载菌数。为了进一步确定ncRNA1351在布鲁氏菌胞内生存和毒力中的作用，又进行了小鼠毒力实验。[0089]选用6-8周龄Balbc小鼠，随机分为4组，每组30只，分别为羊布鲁氏菌Brucellamelitensis16M野生株）组、16MAncRNA1351缺失突变株组、16M-ncRNA1351回复株组和生理盐水阴性对照组。具体步骤为:将羊布鲁氏菌Brucellamelitensis16M野生株、16ΜΔncRNA1351、16M-ncRNA1351培养至对数生长中期OD6qq=1.2，然后对小鼠进行感染，感染部位为腹膜腔，感染次数为1次，每组细菌的感染浓度为5X105CFUmL，每只小鼠注射200μ1。在感染后不同时间点（7、14、28、45d，每个时间点每组取5只小鼠，处死小鼠，无菌条件下迅速取出脾脏，加入ImL含有0.1%TritonX-100的磷酸盐缓冲液，用玻璃匀浆器研磨，制成匀浆，将组织匀浆液进行10倍系列稀释，从中选取适当稀释度的匀浆液各IOOyl涂布TSA平板，计算CFU。[0090]结果如图6所示，可以看出，与羊布鲁氏菌Brucellamelitensis16M相比，在感染后不同时间点ncRNA1351缺失突变株16MAncRNA1351在小鼠体内的生存能力明显减弱，在侵染后45天时，小鼠脾脏内几乎没有ncRNA1351缺失突变株的存在，而ncRNA1351回复株16M_ncRNA1351的生存能力与羊布鲁氏菌Brucellamelitensis16M类似，表明小鼠的毒力减弱的确是由ncRNA1351的缺失引起的。实验结果证实，ncRNA1351与布鲁氏菌的毒力相关。

权利要求：1.用于检测布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351DNA表达的引物，包括：ncRNA1351-RT-F:GGTCGAGAAATTGCGACTGA，和ncRNA135I-RT-R：GGCGGCGTTTTCGTTTC；所述ncRNA1351为来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示，或与序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并与布鲁氏菌毒力和胞内生存能力相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQIDNO:1所示核苷酸序列经硫代修饰或和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。2.检测布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA135IRNA表达的探针，为地高辛标记探针，序列为：ACGGTCGAGAAATTGCGACTGATGCCATCTTAGCTACATACCCCCGGCTGACATGGTAAGGATAGCCCCGGAAAGCCATCGGTTCCCTATAGTGAGTCGTATTA；所述ncRNA1351为来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示，或与序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并与布鲁氏菌毒力和胞内生存能力相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQIDN0:1所示核苷酸序列经硫代修饰或和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。3.布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351回复株，命名为16M-ncRNA1351，其特征在于，在布鲁氏菌野生株16M中转化有ncRNA1351回复载体；所述ncRNA1351为来源于布鲁氏菌的非编码小RNA分子，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO:1所示，或与序列表中SEQIDNO:1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并与布鲁氏菌毒力和胞内生存能力相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQIDN0:1所示核苷酸序列经硫代修饰或和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351回复株，其特征在于，所述回复载体ncRNA1351-MCS其核苷酸序列如序列表中SEQIDN0:3所示，或与序列表中SEQIDN0:3所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并与布鲁氏菌毒力和生存能力相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQIDN0:3所示核苷酸序列经硫代修饰或和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。5.根据权利要求3或4所述布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351回复株，其特征在于，是将回复载体ncRNA1351-MCS质粒DNA电转化至ncRNA1351缺失突变株16MAncRNA1351电感受态细胞，筛选双抗性克隆得到。6.根据权利要求5所述布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351回复株，其特征在于，所述ncRNA1351缺失突变株16MZ\ncRNA1351是以布鲁氏菌Brucellamelitensis16M为出发菌株，转化ncRNA1351缺失突变载体ncRNA1351-NC-T得到。7.根据权利要求6所述布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351回复株，其特征在于，所述ncRNA1351缺失突变载体ncRNA1351-NC-T，其核苷酸序列如序列表中SEQIDN0:2所示，或与序列表中SEQIDN0:2所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并与布鲁氏菌毒力和胞内生存能力相关的核苷酸序列，或为序列表中SEQIDN0:2所示核苷酸序列经硫代修饰或和甲氧基修饰得到的核苷酸序列。8.权利要求3至7任一项所述的非编码小RNA分子ncRNAl351回复株在抗布鲁氏菌药物筛选中的应用。

百度查询： 中国人民武装警察部队总医院 布鲁氏菌的非编码小RNA分子ncRNA1351的应用

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