申请/专利权人：国药集团武汉血液制品有限公司

申请日：2020-06-08

公开（公告）日：2021-09-17

公开（公告）号：CN111549183B

主分类号：C12Q1/70(20060101)

分类号：C12Q1/70(20060101);C12Q1/689(20180101);C12Q1/686(20180101);C12Q1/04(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.09.17#授权;2020.09.11#实质审查的生效;2020.08.18#公开

摘要：本发明涉及一种同时检测新冠肺炎康复者恢复期血浆中SARS‑CoV‑2病毒及其他病原体的方法，所述的方法使用的反应体系包括：1检测SARS‑CoV‑2病毒的引物组，2检测多种其他病原体的检测引物组，3必要的核酸提取试剂及显色试剂；4内部质控核酸样本、扩增质控、阳性质控。所述的同时检测新冠肺炎康复者恢复期血浆中SARS‑CoV‑2病毒及呼吸道病原体为：经过一次核酸提取后，样本进行两次实时荧光PCR检测，分别确定样本中的SARS‑CoV‑2病毒和多种病原微生物。

主权项：1.一种同时检测血浆样品中SARS-CoV-2病毒、和多种其他病原体的检测试剂盒，所述的试剂盒包括：1检测SARS-CoV-2病毒的引物组，2检测多种其他病原体的检测引物组，3必要的核酸提取试剂及显色试剂；所述的检测SARS-CoV-2病毒的引物组为如下两组荧光PCR引物组：SARS-CoV-2靶标一orf1ab:TEXASRED610-BHQ2荧光信号组SEQIDNO.1：正向引物F：CCCTGTGGGTTTTACACTTAASEQIDNO.2：反向引物R：ACGATTGTGCATCAGCTGASEQIDNO.3：荧光探针P：CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG，且该探针5'端为TEXASRED610，3'端为BHQ2；SARS-CoV-2靶标二N:FAM-BHQ1荧光信号组SEQIDNO.4：正向引物F：GGGGAACTTCTCCTGCTAGAATSEQIDNO.5：反向引物R：CAGACATTTTGCTCTCAAGCTGSEQIDNO.6：荧光探针P：TTGCTGCTGCTTGACAGATT，且该探针5'端为FAM，3'端为BHQ1；所述的检测多种其他病原体的引物组为1ROX-BHQ1荧光信号组呼吸道合胞病毒A型引物组：SEQIDNO.7：正向引物F：TGATACACTCAACAAAGATCAACTTCTGSEQIDNO.8：反向引物R：TCTCCTGTGCTCCGTTGGATSEQIDNO.9：荧光探针P：CATCCAGCAAATACAC，且该探针5'端为ROX，3'端为BHQ1；腺病毒引物组:SEQIDNO.10：正向引物F：ATGGCCACCCCTTCGATGASEQIDNO.11：反向引物R：CCCGGACTCAGGTACTCCGASEQIDNO.12：荧光探针P：TACATGCACATCGCCGG，且该探针5'端为ROX，3'端为BHQ1；人偏肺病毒引物组:SEQIDNO.13：正向引物F：GCAACATGAAATAATGAAGAATGTACACSEQIDNO.14：反向引物R：GAGTGCTAATGTTTTTACTCCTCGTTAASEQIDNO.15：荧光探针P：TGAGCTCACACTATTGAA，且该探针5'端为ROX，3'端为BHQ1；呼吸道合胞病毒B型引物组:SEQIDNO.16：正向引物F：GCTTGATGTCAGTTGTGGAACAATSEQIDNO.17：反向引物R：TGTATCTCATTCAGCTTCGGTATGASEQIDNO.18：荧光探针P：CACAAACATATGTCCTAATAGA，且该探针5'端为ROX，3'端为BHQ1；甲型流感病毒引物组:SEQIDNO.19：正向引物F：CTGGGAATGCTGAAATTGAAGATCSEQIDNO.20：反向引物R：TCATATCCACTGGCCACGGCAAGSEQIDNO.21：荧光探针P：CCTGAGAGGATCAGTGGCCCACAAGT，且该探针5'端为ROX，3'端为BHQ1；乙型流感病毒引物组:SEQIDNO.22：正向引物F：CCAGGGATTGCAGACATTGAAGASEQIDNO.23：反向引物R：TGGCTTCGTACCCAACCATAGAGTACTSEQIDNO.24：荧光探针P：TCGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCG，且该探针5'端为ROX，3'端为BHQ1；副流感病毒1型引物组:SEQIDNO.25：正向引物F：ACCCGAAATGACAATTCCSEQIDNO.26：反向引物R：GGATCATGATAATGAAGGACAASEQIDNO.27：荧光探针P：TACACCAGCAGGAAGGACACA，且该探针5'端为ROX，3'端为BHQ1；副流感病毒2型引物组:SEQIDNO.28：正向引物F：CCAACTATCGATTTGCTGSEQIDNO.29：反向引物R：ATCCGGTAGTATTTAGTAGGSEQIDNO.30：荧光探针P：AATGAGTCCAACCGAACCAATCC，且该探针5'端为ROX，3'端为BHQ1；副流感病毒3型引物组:SEQIDNO.31：正向引物F：ACCAGGAAACGATGAATGSEQIDNO.32：反向引物R：GGGTTCACTCTCGATTTCSEQIDNO.33：荧光探针P：AGTATGACAGATGACACAATGCTCC，且该探针5'端为ROX，3'端为BHQ1；副流感病毒4型引物组:SEQIDNO.34：正向引物F：GGTACAATTGCTCTTGGTGSEQIDNO.35：反向引物R：ACTGCCTCATTTGTTTCTGSEQIDNO.36：荧光探针P：ACAAGTTACAGCAGCAATCGGTC，且该探针5'端为ROX，3'端为BHQ1；博卡病毒引物组:SEQIDNO.37：正向引物F：GGAGAGGAAGAGACACTGSEQIDNO.38：反向引物R：GGTGTTCCTGATGATATGAGSEQIDNO.39：荧光探针P：TCATCACAGGAGCAGGAGCC，且该探针5'端为ROX，3'端为BHQ1；2Cy5-BHQ2荧光信号组嗜肺军团杆菌引物组:SEQIDNO.40：正向引物F：TCCTAGTAGTGAAGATGAATGTAATGATGTSEQIDNO.41：反向引物R：AACTTAATATGAGATTTTCCCGCTGCCAACAASEQIDNO.42：荧光探针P：TGCTGCGGTACCCTGCGATTC，且该探针5'端为Cy5，3'端为BHQ2；百日咳鲍特菌引物组:SEQIDNO.43：正向引物F：GGCATCAAGCACCGCTTTAC-SEQIDNO.44：反向引物R：CGGTGTTGGGAGTTCTGSEQIDNO.45：荧光探针P：CGTGCCTGACTACTAGT，且该探针5'端为Cy5，3'端为BHQ2；鼻病毒引物组:SEQIDNO.46：正向引物F：AGACCAATAGTAGGCAACSEQIDNO.47：反向引物R：CCTACTAAGCTCTGTGTASEQIDNO.48：荧光探针P：TCCAGGTTGTCTAAGGTCAAGCAC，且该探针5'端为Cy5，3'端为BHQ2；肠病毒引物组:SEQIDNO.49：正向引物F：CGAACTCAGCATCAGAAGSEQIDNO.50：反向引物R：TCTCGTGTATGACATCCASEQIDNO.51：荧光探针P：ACTACACCACCATCAACTATTACAACG，且该探针5'端为Cy5，3'端为BHQ2；肺炎衣原体引物组:SEQIDNO.52：正向引物F：TGAAGTCGGAATTGCTAGTAATGGSEQIDNO.53：反向引物R：GTGTGTACAAGGCCCGAGAACSEQIDNO.54：荧光探针P：TGTCAGCCATAACGCCGTGAAT，且该探针5'端为Cy5，3'端为BHQ2；肺炎支原体引物组:SEQIDNO.55：正向引物F：GGGAGGCAGCAGTAGGGAATSEQIDNO.56：反向引物R：ACAATCTTAAAGACCTTCATCGTTCASEQIDNO.57：荧光探针P：TTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGA，且该探针5'端为Cy5，3'端为BHQ2；冠状病毒OC43引物组:SEQIDNO.58：正向引物F：GCCTATCAACAACAAGATGSEQIDNO.59：反向引物R：GCAACACTTATATTATCATTTTCTCSEQIDNO.60：荧光探针P：CTTATGACCACGCTGACGCTG，且该探针5'端为Cy5，3'端为BHQ2；冠状病毒NL63引物组:SEQIDNO.61：正向引物F：GTCGTTCTTCAACTCGTAASEQIDNO.62：反向引物R：AAGCCAAAGTAACAGCAGSEQIDNO.63：荧光探针P：CTTCTCGTAGCACTTCAAGACAACAG，且该探针5'端为Cy5，3'端为BHQ2；冠状病毒HKU1引物组:SEQIDNO.64：正向引物F：AGCTGACACTTCTACTCCSEQIDNO.65：反向引物R：GAACCTGGTCGACTATTAGSEQIDNO.66：荧光探针P：AGACCTTCCTGAGCCTTCAACAT，且该探针5'端为Cy5，3'端为BHQ2；冠状病毒C229E引物组:SEQIDNO.67：正向引物F：GTGGATTTGTCACCCAAGSEQIDNO.68：反向引物R：CCTGTAGGTTCAGTTTTAGCSEQIDNO.69：荧光探针P：CAGACGACACCTTCAACACGC，且该探针5'端为Cy5，3'端为BHQ2；HIN1引物组:SEQIDNO.70：正向引物F：GTGGATTTGAGATGATTTGSEQIDNO.71：反向引物R：GCAGTTCATTCCTGTTAASEQIDNO.72：荧光探针P：AACTTCCACTGTATCCTGACCAATCA，且该探针5'端为Cy5，3'端为BHQ2；所述的同时检测SARS-CoV-2病毒和多种病原微生物为，经过一次核酸提取后，样本进行两次实时荧光PCR检测，分别确定样本中的SARS-CoV-2病毒和多种病原微生物；所述的试剂盒还包括，4必要的样本提取内部质控核酸样本，所述的内部质控核酸样本用于同时对SARS-CoV-2病毒的样本检测和多种病原微生物样本的检测进行质量监控，确定PCR反应前，提取核酸样本的过程没有系统错误；所述的内部质控核酸样本为含有一段HIV-1目的基因RNA片段的MS2噬菌体；在对待测血浆进行预处理时，使用蛋白酶K裂解血浆样本后，即加入内部质控核酸样本；5用于检测多个荧光通道是否能够正常显色的AC扩增质控，所述的AC扩增质控核酸在样本核酸提取完毕后，进行PCR扩增前加入。

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