申请/专利权人：西北农林科技大学

申请日：2019-06-10

公开（公告）日：2022-07-19

公开（公告）号：CN110079615B

主分类号：C12Q1/6888

分类号：C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2022.07.19#授权;2019.08.27#实质审查的生效;2019.08.02#公开

摘要：本发明公开了一种检测茶卡羊KMT2D基因CNV标记的方法及其应用：所述的CNV标记是指茶卡羊KMT2D基因候选区域Chr3:136830401‑136832800内的拷贝数变异，以茶卡羊基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR分别扩增茶卡羊KMT2D基因CNV区域和内参基因ANKRD1部分片段，根据2*2‑ΔCt将定量结果分为增加型、减少型和正常型。本发明在DNA水平上检测与茶卡羊体长性状密切相关的CNV标记，可作为茶卡羊生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记，以便快速建立遗传资源优良的茶卡羊种群。

主权项：1.一种与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的检测方法在茶卡羊分子标记辅助选择育种中的应用，其特征在于：所述与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的检测方法，包括以下步骤：以茶卡羊基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR分别扩增茶卡羊KMT2D基因拷贝数变异区域和作为内参序列的ANKRD1基因部分片段，然后根据定量结果鉴定茶卡羊KMT2D基因的拷贝数变异类型，所述的KMT2D基因拷贝数变异区域位于KMT2D基因候选区域Chr3:136830401-136832800；所述的拷贝数变异类型是根据2*2−ΔCt将定量结果分为的三类：增加型，2*2−ΔCt≥2.5；减少型，2*2−ΔCt1.5；正常型，1.5≤2*2−ΔCt2.5；所述的KMT2D基因拷贝数变异区域的不同拷贝数变异类型与茶卡羊的生长性状显著相关，其中，具有正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状上优于具有减少型和增加型拷贝数变异类型的个体；所述的KMT2D基因拷贝数变异区域的扩增引物对为：上游引物F1：5′-TCATTGTTCTGCTTGGCTTGGT-3′，下游引物R1：5′-TGCAGCGAATTTGTCCAGGT-3′；所述的ANKRD1基因部分片段的扩增引物对为：上游引物F2：5′-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3′，下游引物R2：5′-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3′。

全文数据：一种检测茶卡羊KMT2D基因CNV标记的方法及其应用技术领域本发明涉及家畜分子生物学检测领域，具体涉及一种与茶卡羊生长性状相关的KMT2D基因CNV标记的检测方法与应用。背景技术绵羊在世界各地均有饲养，性情温顺，易驯化，可以为人类提供肉和毛皮等产品。茶卡羊属于毛肉兼用半细毛羊，生长于青海高原乌兰县环茶卡盐湖区域，受独特地理气候和土壤环境影响，其羊肉含丰富矿物质和维生素。2013年4月，“茶卡羊”获得国家农业部农产品地理标志认证。拷贝数变异copynumbervariations，CNVs是指基因组DNA中较大片段的缺失或重复现象。CNVs是基因组上一种亚显微水平的结构变异，涉及的片段大小在50bp到数个Mb之间，包括拷贝数增加copynumbergain和拷贝数减少copynumberloss。有些拷贝数变异并不对动植物的表型造成影响，而有些拷贝数变异则通过扰乱基因序列和改变基因含量来影响基因表达，从而造成表型差异和表型适应。目前应用于拷贝数变异检测的技术主要有：1比较基因组杂交CGH：CGH可在全部染色体或染色体亚带水平上，对不同基因组之间DNA序列的拷贝数进行检测，从而发现拷贝数变异。然而该技术分辨率在Mb水平，更小片段的拷贝数片段则不易检出。同时该技术操作繁琐，通量低、耗时长且成本昂贵，需要较为大量的模板DNA，不利于大范围的推广。2多重连接探针扩增技术MLPA：MLPA是2002年发展起来的一种拷贝数检测方法。该技术具有较准确的相对定量功能，但是该方法探针制备较为复杂，同时操作步骤繁琐，耗时长。并且采用毛细管电泳作为分析手段，通量较低、成本较高且属于开放式操作，易于造成PCR产物的污染。3高分辨熔解曲线分析HRM：HRM于2003年发明，其通过精确的变温速率控制以及DNA饱和染料的指示，实现了通过研究PCR产物序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。该技术具有快速、廉价、高通量等优点，同时具有以下不足：该方法实现的前提是突变位点必须是杂合的，从而增加了实验的成本和设计的难度，而且降低了检测的通量。并且，单个核苷酸的差异对于熔解曲线的影响较小，甚至有些差异几乎不影响熔解曲线的偏移，造成检测灵敏度较低。4实时荧光定量PCRqPCR：根据所使用的荧光化学方法的不同，主要分为荧光染料嵌入法和荧光杂交探针法两类。PCR反应体系中加入过量的SYBRGreen染料分子，能特异性地渗入DNA双链并发射荧光信号，而游离的染料分子则仅有很低的荧光本底，几乎不发光，从而确保信号的增加与PCR产物的增加同步，可通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。通过对目的基因具有拷贝数变异及参考基因无拷贝数变异进行相对定量，根据2*2-ΔCt方法统计检测样本候选基因的拷贝数。荧光染料嵌入法的优点是实验成本低、无需设计合成探针、使用方便，可以检测目的片段的绝对拷贝数，但不适用于大样本的高通量检测。5SNP芯片：目前使用较少。6高通量测序技术：当前最有效的检测手段是通过重测序来检测基因组结构变异，但这种方法相较之前的方法成本较高。7杂交技术：主要包括Southernblotting杂交、荧光原位杂交fluorescenceinsituhybridization,FISH、多重扩增探针杂交技术multiplexamplifiableprobehybridization,MAPH等，但这些方法成本比较高，时间长而且不够准确，目前使用较少。分子育种，即分子标记辅助选择molecularmark-assistselection，MAS，该技术是借助DNA分子标记对遗传资源或育种材料进行选择，对畜禽的综合性状进行品种改良。在畜禽育种中，通过对与生长性状密切相关，并且与数量性状紧密关联的DNA标记的选择，达到早期选种和提高育种值准确性的目的，从而在畜禽育种中获得更大的遗传进展。KMT2D基因histone-lysineN-methyltransferase2D是哺乳动物组H3K4单甲基转移酶，属于组蛋白H3赖氨酸4H3K4甲基转移酶家族。该家族具有六个Set1类似的H3K4甲基转移酶，包括KMT2A、KMT2B、KMT2C、KMT2D、KMT2F和KMT2G，其中含有的C-terminalSET结构域，负责H3K4甲基转移酶活性，是维持细胞中KMT2D蛋白稳定所必需的。在以上六种甲基转移酶中，KMT2D的功能与KMT2C相似，KMT2D与确定转录增强剂转录因子的谱系结合，对H3K4具有显著增强的作用。KMT2D基因对肌肉和脂肪组织的发育是必不可少，并在成人组织中广泛表达。KMT2D基因发生突变会导致发育疾病，如歌舞伎综合征和先天性心脏病，甚至导致各种形式的癌症，如膀胱癌、肺癌、子宫内膜癌、食管鳞状细胞癌等。茶卡羊的KMT2D基因位于Ch3:136807906-136846851Oar_v4.0，序列编码5455个氨基酸。但目前，尚未见有关KMT2D基因CNV对茶卡羊生长性状影响的文献报道。发明内容本发明的目的在于提供一种检测茶卡羊KMT2D基因CNV标记的方法及其应用。本发明可以为茶卡羊分子育种提供理论依据，便于茶卡羊生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的茶卡羊种群。为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的检测方法，包括以下步骤：以茶卡羊血液全基因组DNA为模板，以引物对P1和引物对P2为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增茶卡羊KMT2D基因拷贝数变异区域和作为内参序列的ANKRD1基因部分片段，然后根据定量结果鉴定茶卡羊KMT2D基因的拷贝数变异类型，所述的KMT2D基因拷贝数变异区域定位于绵羊KMT2D基因候选区域Chr3:136830401-136832800GenBankOar_v4.0。优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2*2-ΔCt将定量结果分为的三类：增加型，2*2-ΔCt≥2.5；减少型，2*2-ΔCt西北农林科技大学一种检测茶卡羊KMT2D基因CNV标记的方法及其应用4122DNA人工合成1tcattgttctgcttggcttggt22220DNA人工合成2tgcagcgaatttgtccaggt20320DNA3tgggcaccacgaaattctca20419DNA人工合成4tggcagaaatgtgcgaacg19

权利要求：1.一种与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以茶卡羊基因组DNA为模板，通过实时荧光定量PCR分别扩增茶卡羊KMT2D基因拷贝数变异区域和作为内参序列的ANKRD1基因部分片段，然后根据定量结果鉴定茶卡羊KMT2D基因的拷贝数变异类型，所述的KMT2D基因拷贝数变异区域位于KMT2D基因候选区域Chr3:136830401-136832800。2.如权利要求1所述一种与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：所述的拷贝数变异类型是根据2*2-ΔCt将定量结果分为的三类：增加型，2*2-ΔCt≥2.5；减少型，2*2-ΔCt1.5；正常型，1.5≤2*2-ΔCt2.5。3.如权利要求1所述一种与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：所述的KMT2D基因拷贝数变异区域的扩增引物对为：上游引物F1：5′-TCATTGTTCTGCTTGGCTTGGT-3′，下游引物R1：5′-TGCAGCGAATTTGTCCAGGT-3′；所述的ANKRD1基因部分片段的扩增引物对为：上游引物F2：5′-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3′，下游引物R2：5′-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3′。4.如权利要求1所述一种与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的检测方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的反应程序包括以下步骤：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火30s，共39个循环。5.如权利要求1-4中任意一项权利要求所述的方法在茶卡羊分子标记辅助选择育种中的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的KMT2D基因拷贝数变异区域的不同拷贝数变异类型与茶卡羊的生长性状显著相关，其中，具有正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状上优于具有减少型和增加型拷贝数变异类型的个体。7.一种检测与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增茶卡羊KMT2D基因拷贝数变异区域的引物对，所述的KMT2D基因拷贝数变异区域位于KMT2D基因候选区域Chr3:136830401-136832800。8.如权利要求7所述一种检测与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的KMT2D基因拷贝数变异区域的扩增引物对为：上游引物F1：5′-TCATTGTTCTGCTTGGCTTGGT-3′，下游引物R1：5′-TGCAGCGAATTTGTCCAGGT-3′。9.如权利要求7所述一种检测与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增内参序列的引物对，内参序列选自ANKRD1基因部分片段。10.如权利要求9所述一种检测与茶卡羊生长性状相关的CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的ANKRD1基因部分片段的扩增引物对为：上游引物F2：5′-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3′，下游引物R2：5′-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3′。

百度查询： 西北农林科技大学 一种检测茶卡羊KMT2D基因CNV标记的方法及其应用

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD