申请/专利权人：珠海国际旅行卫生保健中心

申请日：2019-05-29

公开（公告）日：2023-09-05

公开（公告）号：CN110205406B

主分类号：C12Q1/70

分类号：C12Q1/70;C12Q1/686

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2023.09.05#授权;2019.10.08#实质审查的生效;2019.09.06#公开

摘要：本发明公开了一种阿尼昂尼昂病毒（ONNV）的检测方法，涉及生物检测技术领域，该方法为将ONNV的982bp片段、卡那霉素（Kana）的205bp片段融入pET‑MS2包装载体得到pET‑MS2‑ONNV、pET‑MS2‑KaIC，并纯化，以纯化后的pET‑MS2‑ONNV作为外部对照，纯化后的pET‑MS2‑KaIC作为内部对照；将等量的内部对照分别加入到待测样品、外部对照、阴性对照，提取病毒核酸后进行RT‑PCR反应检测；反应结束后，判断结果。本检测方法对ONNV检测结果具有高有效性。为方便应用，本发明还制备出一种阿尼昂尼昂病毒的一管双色RT‑PCR试剂盒。

主权项：1.一种阿尼昂尼昂病毒的一管双色RT-PCR试剂盒，其特征在于，其包括纯化后的pET-MS2-KaIC、纯化后的pET-MS2-ONNV、引物ONNV-F、引物ONNV-R、探针ONNV-P、引物Kana-F、引物Kana-R和探针Kana-P；所述引物ONNV-F：5’-TGGATAGGGTTCGATACGACACC-3’；所述引物ONNV-R：5’-TCAGTACCTGCTCATCAGCCCA-3’；所述探针ONNV-P：5’-FAM-TGTACAATGCAATGGCTGGCGCATACCC-BHQ-3’；所述引物Kana-F：5’-CGATACCGTAAAGCACGAGG-3’；所述引物Kana-R：5’-GACCGCTATCAGGACATAGC-3’；所述探针Kana-P：5’-HEX-TCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCA-BHQ-3’。

全文数据：一种阿尼昂尼昂病毒的检测方法及一管双色RT-PCR试剂盒技术领域本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种阿尼昂尼昂病毒的检测方法及一管双色RT-PCR试剂盒。背景技术随着生物技术的发展，传染病病原体的鉴定、检测方法从分离培养到免疫学检测，再到基因检测技术，为临床诊断带来了许多便利。目前，针对传染病病原体的检测，大多使用核酸检测方法。在病原体的定性和定量核酸检测中，实验人员操作中的随机误差、扩增仪孔间温度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、待扩增靶核酸的浓度、逆转录的效率及试剂的问题等，均可能会影响聚合酶链式反应（PCR）扩增的效率，进而造成检测结果的偏差，甚至假阴性、假阳性的结果。在检测过程中，内部对照（IPC）可用于提示抑制剂的有无，对全过程进行控制；外部对照（EPC）可用于试验结果有效性的检验。但是，目前检测实验室大部分自配试剂均没有包含内部对照，即使使用，利用的也大多是病毒、质粒DNA或体外转录RNA，病毒存在潜在的传染危险性；质粒DNA极易造成实验室污染，且一旦污染，较长时间都会存在影响；体外转录RNA也极不稳定，因此，均难以达到实验要求。针对上述问题，业界通过MS2假病毒包装系统构建了一系列披甲RNA，用于检测过程的质量控制，广泛应用于流感病毒、诺如病毒、SARS病毒、HIV-1病毒等的检测。阿尼昂尼昂热是由阿尼昂尼昂病毒O’nyong-nyongvirus，ONNV引起的、被视为一种被忽视的热带流行性传染病，1959~1962年间曾导致东非200多万人感染和发病，沉寂30年后又在非洲发生流行。其症状与基孔肯雅热类似，传播途径却同疟疾类似，均通过按蚊传播。鉴于此，一般通过核酸检测方法进行检测用以鉴别与其症状类似的基孔肯雅热以及与其共享蚊媒的疟疾。目前，已发表的文献中，能用于ONNV检测的核酸检测方法只有4篇报道Liu,etal.2016；Saxton-Shaw,etal.2013；Smith,etal.2009；Waggoner,etal.2017，但是这些方法中均未使用披甲RNA作为IPC和EPC用于ONNV的检测，导致这些检测方法对于检测过程中由于实验人员操作中的随机误差、扩增仪孔间温度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、待扩增靶核酸的浓度、逆转录的效率及试剂等带来的偏差、假阴性、假阳性等影响结果有效性的问题得不到很好的解决。因此，为提高的ONNV核酸检测结果的有效性性，急需发明一种新的ONNV核酸检测方法，并开发出一种能用于ONNV的检测试剂盒。发明内容鉴于上述问题，为提高的ONNV核酸检测结果的有效性，本发明的目的在于提供一种阿尼昂尼昂病毒ONNV的检测方法和试剂盒，避免检测过程中由于实验人员操作中的随机误差、扩增仪孔间温度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、待扩增靶核酸的浓度、逆转录的效率及试剂等带来的偏差、假阴性、假阳性等。本发明的一种阿尼昂尼昂病毒（ONNV）的检测方法，包括如下步骤：（1）分别将ONNV的982bp片段、卡那霉素（Kana）的205bp片段融入pET-MS2包装载体得到pET-MS2-ONNV、pET-MS2-KaIC，并纯化，以纯化后的pET-MS2-ONNV作为外部对照（EPC），纯化后的pET-MS2-KaIC作为内部对照（IPC）；（2）将等量的内部对照（如1×106拷贝）分别加入到待测样品、外部对照、阴性对照，即待测样品组、阳性对照组、阴性对照组，分别在提取病毒核酸后加入扩增反应液、酶混合液、超纯水，混匀、离心，进行RT-PCR扩增和检测；（3）结果判定：反应结束后，根据待测样品的扩增曲线和Ct值判断待测样品是否为ONNV阳性。在上述步骤（2）中阴性对照选用正常人血清。进一步地，在上述步骤（2）中设有空白对照组，不加入内部对照到空白对照中成立空白对照组，提取病毒核酸后加入扩增反应液、酶混合液、超纯水，混匀、离心，进行RT-PCR扩增和检测。空白对照可选用超纯水。进一步地，在上述步骤（2）中进行RT-PCR扩增和检测的反应体积为12.5μL，包含：6.25μL扩增反应液，0.5μL酶混合液，0.75μL超纯水，5μL提取的待测样品的RNA、或5μL阳性对照、或5μL阴性对照、或5μL空白对照。进一步地，在上述步骤（2）中进行RT-PCR扩增和检测的反应条件是：42°C5分钟；95°C10秒钟；40个循环的95°C10秒—60°C30秒；在60°C30秒阶段分别在FAM通道和HEX通道收集荧光信号。更进一步地，在上述步骤（3）中结果判定的方法包括如下步骤：（1）判断质控系统，有效标准：HEX通道所有待测样品、阳性对照、阴性对照的扩增曲线呈现标准的S形曲线，且Ct值一致；同时，FAM通道阳性对照的扩增曲线呈现标准的S形曲线，且Ct值220mM10mMDTT20mM10mMSpermidine1mM0.5mMTween-200.1%0.05%BSA0.2mgL0.1mgLdNTPmix0.4mM0.2mMONNV-F0.8μM0.4μMONNV-R0.8μM0.4μMONNV-P0.4μM0.2μMKana-F0.8μM0.4μMKana-R0.8μM0.4μMKana-P0.4μM0.2μM（2）25X酶混合液：如表2所示，其组分为：7.5UμLAMV反转录酶、25UμLRibonucleaseInhibitor（核糖核酸酶抑制剂）、25UμLHS-Taq酶；表2组分浓度工作浓度AMV反转录酶7.5UμL0.3UμLRibonucleaseInhibitor25UμL1UμLHS-Taq酶25UμL1UμL（3）阳性对照（PC组）：EPC；（4）阴性对照（NC组）：正常人血清，在核酸提取时与标本同时平行提取以作为阴性对照使用；（5）空白对照（空白对照组）：超纯水。5、试剂盒的检测方法（1）提取待测样品的RNA，即模板RNA：先将1×106拷贝的IPC分别加入待测样品、阳性对照、阴性对照，然后按照根据样本类型选用合适的商品化试剂盒提取病毒核酸；（2）按照以下方法配制反应液：反应体积为12.5μL；取6.25μL2X扩增反应液、0.5μL25X酶混合液、0.75μL超纯水加入0.2ml光学PCR反应管，再加入5μL提取的待测样品的RNA、或5μL阳性对照、或5μL阴性对照、或5μL空白对照，振荡混匀后瞬时离心数秒；（3）上机检测：将反应管置于荧光PCR仪上进行扩增和检测。反应条件是：42°C5分钟；95°C10秒钟；40个循环的95°C10秒—60°C30秒；于“60°C30秒”阶段分别在FAM通道和HEX通道收集荧光信号。（4）结果判定：首先是判断质控系统，有效性标准：HEX通道所有待测样品、阳性对照、阴性对照的扩增曲线呈现标准的S形曲线，且Ct值一致；同时，FAM通道阳性对照的扩增曲线呈现标准的S形曲线，且Ct值珠海国际旅行卫生保健中心一种阿尼昂尼昂病毒的检测方法及一管双色RT-PCR试剂盒6SIPOSequenceListing1.0123DNA人工序列O'nyong-nyongvirusmisc_feature1..23正向引物ONNV-F1tggatagggttcgatacgacacc23222DNA人工序列O'nyong-nyongvirusmisc_feature1..22反向引物ONNV-R2tcagtacctgctcatcagccca22328DNA人工序列O'nyong-nyongvirusmisc_feature1..28探针ONNV-P3tgtacaatgcaatggctggcgcataccc28420DNA人工序列O'nyong-nyongvirusmisc_feature1..20正向引物Kana-F4cgataccgtaaagcacgagg20520DNA人工序列O'nyong-nyongvirusmisc_feature1..20反向引物Kana-R5gaccgctatcaggacatagc20627DNA人工序列O'nyong-nyongvirusmisc_feature1..27探针Kana-P6tcagcccattcgccgccaagctcttca27

权利要求：1.一种阿尼昂尼昂病毒（ONNV）的检测方法，包括如下步骤：（1）分别将ONNV的982bp片段、卡那霉素（Kana）的205bp片段融入pET-MS2包装载体得到pET-MS2-ONNV、pET-MS2-KaIC，并纯化，以纯化后的pET-MS2-ONNV作为外部对照，纯化后的pET-MS2-KaIC作为内部对照；（2）将等量的所述内部对照分别加入到待测样品、所述外部对照、阴性对照，即待测样品组、阳性对照组、阴性对照组，分别在提取病毒核酸后加入扩增反应液、酶混合液、超纯水，混匀、离心，进行RT-PCR扩增和检测；（3）结果判定：反应结束后，根据待测样品的扩增曲线和Ct值判断待测样品是否为ONNV阳性。2.如权利要求1所述的阿尼昂尼昂病毒（ONNV）的检测方法，其特征在于，在步骤（2）中设有空白对照组，将所述内部对照不加入到空白对照中成立所述空白对照组，在提取病毒核酸后加入扩增反应液、酶混合液、超纯水，混匀、离心，进行RT-PCR扩增和检测。3.如权利要求2所述的阿尼昂尼昂病毒（ONNV）的检测方法，其特征在于，进行RT-PCR扩增和检测的反应体积为12.5μL，包含：6.25μL扩增反应液，0.5μL酶混合液，0.75μL超纯水，5μL提取的待测样品的RNA、或5μL阳性对照、或5μL阴性对照、或5μL空白对照。4.如权利要求1所述的阿尼昂尼昂病毒（ONNV）的检测方法，其特征在于，进行RT-PCR扩增和检测的反应条件是：42°C5分钟；95°C10秒钟；40个循环的95°C10秒—60°C30秒；在所述60°C30秒阶段分别在FAM通道和HEX通道收集荧光信号。5.如权利要求4所述的阿尼昂尼昂病毒（ONNV）的检测方法，其特征在于，步骤（3）中结果判定的方法包括如下步骤：（1）判断质控系统，有效标准：HEX通道所有待测样品、阳性对照、阴性对照的扩增曲线呈现标准的S形曲线，且Ct值一致；同时，FAM通道阳性对照的扩增曲线呈现标准的S形曲线，且Ct值30，阴性对照无S形曲线；（2）在质控系统有效时，判断待检样品结果：当待检样品FAM通道无S形曲线时，判为ONNV阴性；当待检样品FAM通道有S形曲线，且Ct值≤38时，判为ONNV阳性；当待测样品FAM通道有S形曲线，且Ct值介于38和40之间时，浓缩待测样品，再重新检测；当重新检测待测样品FAM通道有S形曲线，且Ct值介于38和40之间，但Ct值有减少且曲线有对数增长期时，判为ONNV阳性；当重新检测检测样品FAM通道无荧光增幅现象时，判为ONNV阴性。6.如权利要求1所述的阿尼昂尼昂病毒（ONNV）的检测方法，其特征在于，所述扩增反应液包括ONNV的正向引物：5’-TGGATAGGGTTCGATACGACACC-3’；反向引物：5’-TCAGTACCTGCTCATCAGCCCA-3’；探针：5’-FAM-TGTACAATGCAATGGCTGGCGCATACCC-BHQ-3’和Kana的正向引物：5’-CGATACCGTAAAGCACGAGG-3’；反向引物：5’-GACCGCTATCAGGACATAGC-3’；探针：5’-HEX-TCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCA-BHQ-3’。7.一种阿尼昂尼昂病毒的一管双色RT-PCR试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1-6任一项所述的内部对照、外部对照。8.如权利要求7所述的阿尼昂尼昂病毒的一管双色RT-PCR试剂盒，其特征在于，还包括2X扩增反应液：100mMTris-HClpH8.3、100mMKCl、20mMMgCl2、1mMSpermidine、0.1%Tween-20、0.2mgLBSA、0.4mMdNTP、0.8μM引物ONNV-F、0.8μM引物ONNV-R、0.4μM探针ONNV-P、0.8μM引物Kana-F、0.8μM引物Kana-R、0.4μM探针Kana-P。9.如权利要求8所述的阿尼昂尼昂病毒的一管双色RT-PCR试剂盒，其特征在于，所述引物ONNV-F：5’-TGGATAGGGTTCGATACGACACC-3’；所述引物ONNV-R：5’-TCAGTACCTGCTCATCAGCCCA-3’；所述探针ONNV-P：5’-FAM-TGTACAATGCAATGGCTGGCGCATACCC-BHQ-3’；所述引物Kana-F：5’-CGATACCGTAAAGCACGAGG-3’；所述引物Kana-R：5’-GACCGCTATCAGGACATAGC-3’；所述探针Kana-P：5’-HEX-TCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCA-BHQ-3’。10.如权利要求7所述的阿尼昂尼昂病毒的一管双色RT-PCR试剂盒，其特征在于，还包括25X酶混合液：7.5UμLAMV反转录酶、25UμLRibonucleaseInhibitor、25UμLHS-Taq酶。

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