申请/专利权人：上海宏序生物科技有限公司

申请日：2023-08-01

公开（公告）日：2023-12-08

公开（公告）号：CN117187351A

主分类号：C12Q1/6844

分类号：C12Q1/6844

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2023.12.26#实质审查的生效;2023.12.08#公开

摘要：本发明公开了一种5’瓣状核酸酶及茎环适配子结构介导的等温扩增方法，利用Taq酶的5’瓣状核酸内切酶的特性，释放出互补配对的茎环状适配子引物；茎环状适配子引物之间互补扩增补齐缺口，在等温扩增酶和外源引物的作用下进行等温扩增；通过5’FEN酶的内切酶作用和茎环结构适配子引物，实现由目的检测片段至哑铃状等温扩增的转换，达到指数级等温扩增检测要求，同时只需对目的基因设计两对或以上类巢式引物，即可达到特异性、灵敏度高的检测需求，无需设计繁琐的多引物对扩增，另外通过对外源DNA的结构设计，减少其非特异性扩增，达到降低假阳性的目的。

主权项：1.一种5’瓣状核酸酶及茎环适配子结构介导的等温扩增方法，其特征在于，利用Taq酶的5’瓣状核酸内切酶的特性，释放出互补配对的茎环状适配子引物；茎环状适配子引物之间互补扩增补齐缺口，在等温扩增酶和外源引物的作用下进行等温扩增，具体包括以下步骤：S1、设计引物：a、针对目的基因设计引物，引物包含两对，分别为AB和CD；b、所述AB为外侧双向引物，引物长度为10-60nt，用于锚定目的基因，扩增子长度不限；c、所述茎环状适配子引物包括三部分序列，自身成环的茎环结构stem-loop、一段适配子区域、3’端与目的基因识别的引物，所述3’端与目的基因识别的引物即为引物CD，除引物C和D外，其余序列在目的基因上没有识别区域，所述AB引物序列与CD茎环结构区域无识别区域；d、所述引物CD位于外侧双向引物A和B的扩增区域内，分别识别双链DNA的两条链；两个茎环状适配子引物分别标记为SLC和SLD；e、所述两个茎环状适配子引物的适配子部分反向互补；f、所述茎环结构上设计等温扩增引物SLP；g、设计等温扩增引物：所述等温扩增引物长度为10-60nt，与茎环结构部分区域反向互补；S2、目的基因识别及探针置换、延伸，形成双端茎环结构：a、获得需要检测的样本DNARNA即目的基因，DNA可直接用于后续检测，RNA需通过常见的反转录步骤获得对应cDNA后用于后续检测；b、所述AB引物对识别目的基因位点，并结合在目的基因上，在taq酶的作用下开始扩增；c、所述SLC和SLD的3’端C、D引物序列分别识别目的基因位点，由于DNA聚合酶的5’FEN酶活性，SLC和SLD的茎环结构和适配子区域分别被切割并释放出来；d、所述两个茎环结构和适配子区域序列3’端互补，在taq酶作用下延伸补平，形成双端茎环结构；S3、等温扩增：a、所述SLP引物识别退火；b、加入等温扩增引物，开始哑铃状等温扩增；e、通过荧光或浊度仪鉴定扩增结果。

全文数据：

权利要求：

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