申请/专利权人：上海市儿童医院

申请日：2023-10-18

公开（公告）日：2024-01-05

公开（公告）号：CN117343903A

主分类号：C12N5/0797

分类号：C12N5/0797;C12N5/02;C12N5/0735;C12N5/0793

优先权：

专利状态码：在审-实质审查的生效

法律状态：2024.01.23#实质审查的生效;2024.01.05#公开

摘要：本发明公开了一种悬浮培养神经干细胞的方法。本发明中，Poly‑HEMA可用于神经干细胞悬浮培养时，包被培养皿的低吸附材料。其理化性质稳定，细胞毒性小，可广泛用于各类细胞的悬浮培养体系。申请人首次在神经干细胞培养中发现，使用Poly‑HEMA包被后的培养皿用于悬浮神经干细胞培养和神经球形成试验时，能够帮助维持神经干细胞的增殖效率，提高神经球的成球率，同时本方法价格低廉，使用方便，适合用于大规模实验，用此方法培养出的神经干细胞可以最大程度保留神经干细胞增殖潜能，且批次效应小，能够提高神经干细胞相关研究的效率。

主权项：1.一种悬浮培养神经干细胞的方法，其特征在于：所述悬浮培养神经干细胞的方法包括以下步骤：S1：先处理培养皿，以无水乙醇作为溶剂，在常温下配制2％Poly-HEMA聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯；配制完成后，溶液应为无色透明溶液；S2：用Poly-HEMA包被培养皿，用于小鼠原代神经干细胞培养；S3：用剪刀将小鼠头部剪下，去除头骨和脑膜，将脑组织置于冰冷的DMEMF12Gibco中，在立体显微镜Nikon下解剖大脑皮层；然后用无菌眼科剪刀将皮质组织切碎，用1ml移液管反复吹打，机械分离碎片；S4：最后，将组织碎片转移到15ml离心管中；将2mLTrypLE酶Gibco和250UmLDNA酶DNaseIThermoFisherScientific加入离心管中，在37℃恒温室中消化15分钟，然后在1000rpm下离心；S5：去除上清，将细胞重悬于神经干细胞培养基DMEMF12,Gibco中，添加不含维生素A的B-27ThermoFisherScientific，20ngmL表皮生长因子EGF，Peprotech和20ngmL成纤维细胞生长因子-2bFGF，Peprotech；然后以每皿10厘米皿2个脑的密度播种细胞，2-3天后，增殖的细胞聚集形成神经球；S6：在步骤S5中培养的过程中，神经干细胞以悬浮状态存在于培养基中，具有增殖特性的神经干细胞在悬浮状态会增殖、聚集成球状，这种由神经干细胞组成的细胞球就叫做神经球；S7：将上述传代到第十代的poly-HEMA神经球消化成单细胞，并接种到用PDL包被的玻璃盖玻片上，加入神经元成熟培养基，观察神经干细胞分化的结果；S8：验证了poly-HEMA可以用在小鼠原代神经干细胞培养中，提高其培养效率，接下来将这一系统拓展到人胚胎干细胞定向分化体系S9：开始诱导分化，诱导分化的步骤为：步骤1：取生长状态良好的hESCs胚胎干细胞，用Accutase消化后，用含有10μMY27632的干细胞培养基重悬细胞转移到poly-HEMA包被过的培养皿中；步骤2：第一天换入不加Y27632的干细胞培养基；步骤3：第二天配置诱导培养基，其中各个小分子浓度为：BMP信号通路抑制剂DMH10.5-2μM、TGFβ信号通路抑制剂SB4315421-10μM；步骤4：分化第4天时，采用步骤3的小分子浓度，配置分化培养基二给细胞换液，培养3天，以形成拟胚体EB；步骤5：第7天将形成的拟胚体EB全部转移到Matrigel包被过的六孔板上，并且用配置好的诱导培养基给细胞隔天换液，培养6天；步骤6：第13天挑出此时神经管结构形成的中心隆起，将所有细胞转移到poly-HEMA包被过的培养皿中，用诱导培养基再悬浮培养，隔天换液；步骤7：为了验证神经干细胞是否能分化为神经元，到第15天左右，即可进行分化步骤；取出神经球，用Accutase消化成单细胞，然后铺在包被了laminin的圆形玻片上，加成熟培养基，10天左右可以染色成熟神经元标志物，MAP-2。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 上海市儿童医院 一种悬浮培养神经干细胞的方法

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